y*******a
发帖数: 303 | 1 我最近一直在克隆一个protein kinase gene，连在T-easy vector 上还挺轻松，然后
通过粘性末端切下来， 和pCambia binary vector 相连转入E.Coli后就出现问题了。
有时候菌很难长，有时候长的size正常，做colony PCR没有，以为是gene 太长（3.5kb
）普通的Taqpolymerase很难PCR出来，所以用基因的部分片段PCR，colony PCR都有条
带。提取plasmid后酶切总是很乱，所幸去测序，但都是没测序结果。请问是不是
protein kinase的表达会影响E.coli？
非常感谢！ |
o**d
发帖数: 3080 | 2 有专门用来做高保真长片段克隆的酶， 好像是roche的。 |
y*******a
发帖数: 303 | 3
我们也是用高保真酶P的全长。我是觉得colony PCR 没必要用高保真酶检验。我的
promoter是35S，不知道是不是E.Coli体内无法接受protein kinase?
【在 o**d 的大作中提到】
: 有专门用来做高保真长片段克隆的酶， 好像是roche的。
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y*******a
发帖数: 303 | 4
我可以得到基因的全长，只是觉得用高保真酶做colony PCR比较浪费。我用的promoter
是35S.不知道是不是因为E.Coli自身接受不了protein kinase的表达？
【在 o**d 的大作中提到】
: 有专门用来做高保真长片段克隆的酶， 好像是roche的。
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o**d
发帖数: 3080 | 5 有点不太明白了。
你是要用ecoli来表达kinase这个protein还是只有用ecoli来做克隆？
promoter
【在 y*******a 的大作中提到】
:
: 我可以得到基因的全长，只是觉得用高保真酶做colony PCR比较浪费。我用的promoter
: 是35S.不知道是不是因为E.Coli自身接受不了protein kinase的表达？
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y*******a
发帖数: 303 | 6 只是用E.Coli来做克隆。因为以前有个老师说过在E.Coli里overexpress protein
kiase，会让E。Coli自身受不了。我是想在版上问问有没有这种说法? |
o**d
发帖数: 3080 | 7 没听说过。
【在 y*******a 的大作中提到】
: 只是用E.Coli来做克隆。因为以前有个老师说过在E.Coli里overexpress protein
: kiase，会让E。Coli自身受不了。我是想在版上问问有没有这种说法?
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g*****n
发帖数: 250 | 8 那个基因装在真核表达载体上，怎么会在原核细菌里表达。
【在 y*******a 的大作中提到】
: 只是用E.Coli来做克隆。因为以前有个老师说过在E.Coli里overexpress protein
: kiase，会让E。Coli自身受不了。我是想在版上问问有没有这种说法?
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l**********1
发帖数: 5204 | 9 LZ next might try Hek293 or sf9 cell lines transformation for
protein expression.
【在 g*****n 的大作中提到】
: 那个基因装在真核表达载体上，怎么会在原核细菌里表达。
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k****l
发帖数: 279 | 10 基因在哪个promoter下？如果是 T7，在expression strain 像 BL21（DE3）中表达可
能会有问题，但你克隆应该用 DH5alpha
【在 y*******a 的大作中提到】
: 只是用E.Coli来做克隆。因为以前有个老师说过在E.Coli里overexpress protein
: kiase，会让E。Coli自身受不了。我是想在版上问问有没有这种说法?
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y*******a
发帖数: 303 | 11
我的promoter 是35S。 strain是DH5alpha。
【在 k****l 的大作中提到】
: 基因在哪个promoter下？如果是 T7，在expression strain 像 BL21（DE3）中表达可
: 能会有问题，但你克隆应该用 DH5alpha
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