b*********8
发帖数: 44 | 1 最近用烟草叶片做western，用的载体上只有一个flag，用的sigma的单抗ANTI-FLAG M2
-Peroxidase (HRP) antibody produced in mouse 来检测（由于这是一抗，已经联了
HRP了，所以就不用二抗了），结果阴性对照也有很强的目标带。请问是什么问题？请
有经验的战友帮忙了！谢谢了！！ |
c********b
发帖数: 363 | 2 烟草的话不用任何抗体，大概32 Kda的位置总是有一个带，不过要曝一分钟（用Pierce
的Pico）才看得到。如果是核蛋白，你提核这个带就会不见。
FLAG的话烟草在110Kda左右总是有杂带。如果你的蛋白正好是在这两个区间，没办法，
换tag吧。
你可以看看下面这篇文献：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gateway-compatible%20v
M2
【在 b*********8 的大作中提到】
: 最近用烟草叶片做western，用的载体上只有一个flag，用的sigma的单抗ANTI-FLAG M2
: -Peroxidase (HRP) antibody produced in mouse 来检测（由于这是一抗，已经联了
: HRP了，所以就不用二抗了），结果阴性对照也有很强的目标带。请问是什么问题？请
: 有经验的战友帮忙了！谢谢了！！
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b*********8
发帖数: 44 | 3 非常感谢！我做的确实在阴性对照中有两条很强的带，一条大约110K， 另一条约50K.
我的目标蛋白大约120-130K，所以很难分开。 我用的是pGWB系列的载体，那篇文章用
的是平pEG系列载体，这可能是大小不太一样的原因吧。我的载体上只有一个Flag，所
以很难看出目标带比阴性对照更强。
如果不换载体，用bead 纯化会不会有效果那？因为我已经构建了很多载体了！非常感
谢！
Pierce
【在 c********b 的大作中提到】
: 烟草的话不用任何抗体，大概32 Kda的位置总是有一个带，不过要曝一分钟（用Pierce
: 的Pico）才看得到。如果是核蛋白，你提核这个带就会不见。
: FLAG的话烟草在110Kda左右总是有杂带。如果你的蛋白正好是在这两个区间，没办法，
: 换tag吧。
: 你可以看看下面这篇文献：
: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gateway-compatible%20v
:
: M2
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c********b
发帖数: 363 | 4 我个人不觉得1x的flag是个问题，我自己在c端用pcr加了一个flag，连linker都没有,
检测也没有问题.
最关键的是表达量。加p19，多放点Acetosyringone. 用6%的胶或者gradient的胶，我
试过类似情况，还是能分开的，虽然杂带去不掉。
最好还是换gfp的载体，wb前还能先看到荧光，方便多了。你反正是用gateway系统，换
来换去的麻烦比wb trouble shooting要小多了。
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【在 b*********8 的大作中提到】
: 非常感谢！我做的确实在阴性对照中有两条很强的带，一条大约110K， 另一条约50K.
: 我的目标蛋白大约120-130K，所以很难分开。 我用的是pGWB系列的载体，那篇文章用
: 的是平pEG系列载体，这可能是大小不太一样的原因吧。我的载体上只有一个Flag，所
: 以很难看出目标带比阴性对照更强。
: 如果不换载体，用bead 纯化会不会有效果那？因为我已经构建了很多载体了！非常感
: 谢！
:
: Pierce
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b*********8
发帖数: 44 | 5 非常感谢！我再试试吧，不行就换了。我的蛋白连GFP没有功能，连HA还有功能，anti-
HA 效果怎么样？大家都用那个公司的抗体？直接买带HRP的一抗效果好那还是用一抗，
二抗？ |
s****l
发帖数: 395 | 6 anti-HA monoclonal antibody (12CA5; Roche)很好用
anti-
【在 b*********8 的大作中提到】
: 非常感谢！我再试试吧，不行就换了。我的蛋白连GFP没有功能，连HA还有功能，anti-
: HA 效果怎么样？大家都用那个公司的抗体？直接买带HRP的一抗效果好那还是用一抗，
: 二抗？
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b*********8
发帖数: 44 | 7 anti-HA monoclonal antibody (12CA5; Roche)是一抗吧，二抗用什么好那？
文献中很多都用Roche的3F10,这个怎么样， Anti-HA-Peroxidase, High Affinity
from rat IgG1？ 是不是就这个一抗就有HRP了，不用二抗检测了？谢谢！ |
