b*********8 发帖数: 44 | 1 最近用烟草叶片做western,用的载体上只有一个flag,用的sigma的单抗ANTI-FLAG M2
-Peroxidase (HRP) antibody produced in mouse 来检测(由于这是一抗,已经联了
HRP了,所以就不用二抗了),结果阴性对照也有很强的目标带。请问是什么问题?请
有经验的战友帮忙了!谢谢了!! |
c********b 发帖数: 363 | 2 烟草的话不用任何抗体,大概32 Kda的位置总是有一个带,不过要曝一分钟(用Pierce
的Pico)才看得到。如果是核蛋白,你提核这个带就会不见。
FLAG的话烟草在110Kda左右总是有杂带。如果你的蛋白正好是在这两个区间,没办法,
换tag吧。
你可以看看下面这篇文献:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gateway-compatible%20v
M2
【在 b*********8 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 最近用烟草叶片做western,用的载体上只有一个flag,用的sigma的单抗ANTI-FLAG M2 : -Peroxidase (HRP) antibody produced in mouse 来检测(由于这是一抗,已经联了 : HRP了,所以就不用二抗了),结果阴性对照也有很强的目标带。请问是什么问题?请 : 有经验的战友帮忙了!谢谢了!!
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b*********8 发帖数: 44 | 3 非常感谢!我做的确实在阴性对照中有两条很强的带,一条大约110K, 另一条约50K.
我的目标蛋白大约120-130K,所以很难分开。 我用的是pGWB系列的载体,那篇文章用
的是平pEG系列载体,这可能是大小不太一样的原因吧。我的载体上只有一个Flag,所
以很难看出目标带比阴性对照更强。
如果不换载体,用bead 纯化会不会有效果那?因为我已经构建了很多载体了!非常感
谢!
Pierce
【在 c********b 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 烟草的话不用任何抗体,大概32 Kda的位置总是有一个带,不过要曝一分钟(用Pierce : 的Pico)才看得到。如果是核蛋白,你提核这个带就会不见。 : FLAG的话烟草在110Kda左右总是有杂带。如果你的蛋白正好是在这两个区间,没办法, : 换tag吧。 : 你可以看看下面这篇文献: : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gateway-compatible%20v : : M2
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c********b 发帖数: 363 | 4 我个人不觉得1x的flag是个问题,我自己在c端用pcr加了一个flag,连linker都没有,
检测也没有问题.
最关键的是表达量。加p19,多放点Acetosyringone. 用6%的胶或者gradient的胶,我
试过类似情况,还是能分开的,虽然杂带去不掉。
最好还是换gfp的载体,wb前还能先看到荧光,方便多了。你反正是用gateway系统,换
来换去的麻烦比wb trouble shooting要小多了。
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【在 b*********8 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 非常感谢!我做的确实在阴性对照中有两条很强的带,一条大约110K, 另一条约50K. : 我的目标蛋白大约120-130K,所以很难分开。 我用的是pGWB系列的载体,那篇文章用 : 的是平pEG系列载体,这可能是大小不太一样的原因吧。我的载体上只有一个Flag,所 : 以很难看出目标带比阴性对照更强。 : 如果不换载体,用bead 纯化会不会有效果那?因为我已经构建了很多载体了!非常感 : 谢! : : Pierce
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b*********8 发帖数: 44 | 5 非常感谢!我再试试吧,不行就换了。我的蛋白连GFP没有功能,连HA还有功能,anti-
HA 效果怎么样?大家都用那个公司的抗体?直接买带HRP的一抗效果好那还是用一抗,
二抗? |
s****l 发帖数: 395 | 6 anti-HA monoclonal antibody (12CA5; Roche)很好用
anti-
【在 b*********8 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 非常感谢!我再试试吧,不行就换了。我的蛋白连GFP没有功能,连HA还有功能,anti- : HA 效果怎么样?大家都用那个公司的抗体?直接买带HRP的一抗效果好那还是用一抗, : 二抗?
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b*********8 发帖数: 44 | 7 anti-HA monoclonal antibody (12CA5; Roche)是一抗吧,二抗用什么好那?
文献中很多都用Roche的3F10,这个怎么样, Anti-HA-Peroxidase, High Affinity
from rat IgG1? 是不是就这个一抗就有HRP了,不用二抗检测了?谢谢! |