s****r 发帖数: 736 | 1 求教一个技术问题:
目的是在plasmid上一次引入三个site-directed mutation. 三个位点,间隔150bp, 800
bp, 和2K bp. 准备尝试用QuickChange Multiple Site-Directed Mutagenesis,但是
害怕间隔相差太大PCR会出错。也看了其他的一些方法,比如Andreas Seyfang &
Huaqian Jing的Multiple site-directed mutagenesis of more than 10 sites
simultaneously and in a single round (the schematic diagram was attached).
不过不确定accuracy和efficiency到底怎样。
不知道大家有什么好的建议?谢谢了先! |
s******y 发帖数: 435 | 2 plasmid有多大,如果没超过8,9K的话,还是建议用Stratagene的那个QuickChange kit
,大不了就是做3次,顺利的话一周之内搞定。这篇paper提的方法倒是挺有意思,但是
不知道实际操作起来如何,以后如果有机会的话(比如碰到做大规模alanine screenin
g的时候)可以试试。
800
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【在 s****r 的大作中提到】 : 求教一个技术问题: : 目的是在plasmid上一次引入三个site-directed mutation. 三个位点,间隔150bp, 800 : bp, 和2K bp. 准备尝试用QuickChange Multiple Site-Directed Mutagenesis,但是 : 害怕间隔相差太大PCR会出错。也看了其他的一些方法,比如Andreas Seyfang & : Huaqian Jing的Multiple site-directed mutagenesis of more than 10 sites : simultaneously and in a single round (the schematic diagram was attached). : 不过不确定accuracy和efficiency到底怎样。 : 不知道大家有什么好的建议?谢谢了先!
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w******n 发帖数: 767 | 3 用高保真酶,整完了,测序确认,问题不大。
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【在 s****r 的大作中提到】 : 求教一个技术问题: : 目的是在plasmid上一次引入三个site-directed mutation. 三个位点,间隔150bp, 800 : bp, 和2K bp. 准备尝试用QuickChange Multiple Site-Directed Mutagenesis,但是 : 害怕间隔相差太大PCR会出错。也看了其他的一些方法,比如Andreas Seyfang & : Huaqian Jing的Multiple site-directed mutagenesis of more than 10 sites : simultaneously and in a single round (the schematic diagram was attached). : 不过不确定accuracy和efficiency到底怎样。 : 不知道大家有什么好的建议?谢谢了先!
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b******n 发帖数: 4225 | 4 这个方法看起来很有意思,只是如果有的mutation primer没有annealing到template
strand上,那不就没突变成功么?
10个位点啊,我不相信能有100%的正确性
多少会有一些少于10个位点突变成功的
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【在 s****r 的大作中提到】 : 求教一个技术问题: : 目的是在plasmid上一次引入三个site-directed mutation. 三个位点,间隔150bp, 800 : bp, 和2K bp. 准备尝试用QuickChange Multiple Site-Directed Mutagenesis,但是 : 害怕间隔相差太大PCR会出错。也看了其他的一些方法,比如Andreas Seyfang & : Huaqian Jing的Multiple site-directed mutagenesis of more than 10 sites : simultaneously and in a single round (the schematic diagram was attached). : 不过不确定accuracy和efficiency到底怎样。 : 不知道大家有什么好的建议?谢谢了先!
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i***l 发帖数: 1656 | 5 nod
plasmid有多大,如果没超过8,9K的话,还是建议用Stratagene的那个QuickChange kit
,大不了就是做3次,顺利的话一周之内搞定。
this is well established, and commercially QCed
kit
screenin
【在 s******y 的大作中提到】 : plasmid有多大,如果没超过8,9K的话,还是建议用Stratagene的那个QuickChange kit : ,大不了就是做3次,顺利的话一周之内搞定。这篇paper提的方法倒是挺有意思,但是 : 不知道实际操作起来如何,以后如果有机会的话(比如碰到做大规模alanine screenin : g的时候)可以试试。 : : 800 : .
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