C*********u
发帖数: 811 | 1 最近抽RNA用nanodrop测浓度，发现260/230ratio很不稳定，有时很好有时很低（～0.5
），而260/280 ratio却一直很好。
我已经用70%的ETOH洗两次了，而且在extraction的时候尽量避免protein和pheno污染
了，用的也是分装的nuclease free的水，实在是百思不得其解。
请问大家低260/230ratio会影响之后的RT和qPCR吗？
谢谢 |
b**********8
发帖数: 349 | |
B******o
发帖数: 496 | 3 遇到过太低时有些sample RT不太好的情况，大多数情况下不影响
260/230太低说明你有其他溶剂的影响，多半是乙醇没有晾干。
我的做法是乙醇洗完以后用枪头吸掉所有乙醇，然后离心甩一下，再把剩下的乙醇吸掉
。晾干10-15min加水溶解。一般都应该在1.5以上
.5
【在 C*********u 的大作中提到】
: 最近抽RNA用nanodrop测浓度，发现260/230ratio很不稳定，有时很好有时很低（～0.5
: ），而260/280 ratio却一直很好。
: 我已经用70%的ETOH洗两次了，而且在extraction的时候尽量避免protein和pheno污染
: 了，用的也是分装的nuclease free的水，实在是百思不得其解。
: 请问大家低260/230ratio会影响之后的RT和qPCR吗？
: 谢谢
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C*********u
发帖数: 811 | 4 谢谢你的suggestion
我就是按你这个做法的，在室温dry了差不多有15-20分钟了
我发现我的RNA sample浓度越低（20-50ng/ul），260/230 ratio也越低(0.4-0.6)。。。
【在 B******o 的大作中提到】
: 遇到过太低时有些sample RT不太好的情况，大多数情况下不影响
: 260/230太低说明你有其他溶剂的影响，多半是乙醇没有晾干。
: 我的做法是乙醇洗完以后用枪头吸掉所有乙醇，然后离心甩一下，再把剩下的乙醇吸掉
: 。晾干10-15min加水溶解。一般都应该在1.5以上
:
: .5
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l**********1
发帖数: 5204 | 5 RE LZ 我就是按你这个做法的，在室温dry了差不多有15-20分钟了
How to put your RNA extraction last process 1.5ml tube for drying?
I mean you put it likes a "U" or "upset U" or "C" or "left direction C"
and on what material? i mean lab tissue paper or not?
RNase free environment including atmosphere You Sure?
plus no proteins contamination You sure too?
htp://www.flychip.org.uk/protocols/gene_expression/rna_qc.pdf
。。
【在 C*********u 的大作中提到】
: 谢谢你的suggestion
: 我就是按你这个做法的，在室温dry了差不多有15-20分钟了
: 我发现我的RNA sample浓度越低（20-50ng/ul），260/230 ratio也越低(0.4-0.6)。。。
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n****0
发帖数: 696 | 6 我也是这种情况，不过好像没有关系，的确浓度越低ratio越不好，不知道为什么。不
是说不能晾太久么？否则溶不了么？我都是溶了又在60度加热10min，不知道这样是不
是不好。你用什么方法提RNA？
而且我觉得qPCR的误差特别大。相同样品每次做出来都不太一样，biological
replicates就更没准了，除非差异非常明显。不知道大家有没有同感，还是我个人的问
题？
.5
【在 C*********u 的大作中提到】
: 最近抽RNA用nanodrop测浓度，发现260/230ratio很不稳定，有时很好有时很低（～0.5
: ），而260/280 ratio却一直很好。
: 我已经用70%的ETOH洗两次了，而且在extraction的时候尽量避免protein和pheno污染
: 了，用的也是分装的nuclease free的水，实在是百思不得其解。
: 请问大家低260/230ratio会影响之后的RT和qPCR吗？
: 谢谢
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m*******m
发帖数: 127 | 7 我用phenol／chloroform提取时也常有这个问题，最后发现两相分离时要格外小心，离
心两次就好了。
用RNeasy倒是没这个问题，不过我第二次洗离心后转移到干的collection tube里，再
离心至少两分钟，如果是Nano column的话离心5分钟。 |
o*****r
发帖数: 156 | 8 放在hood里dry，快很多！
。。
【在 C*********u 的大作中提到】
: 谢谢你的suggestion
: 我就是按你这个做法的，在室温dry了差不多有15-20分钟了
: 我发现我的RNA sample浓度越低（20-50ng/ul），260/230 ratio也越低(0.4-0.6)。。。
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k****o
发帖数: 589 | 9
qPCR不应该这样的，机器做校正了吗？
【在 n****0 的大作中提到】
: 我也是这种情况，不过好像没有关系，的确浓度越低ratio越不好，不知道为什么。不
: 是说不能晾太久么？否则溶不了么？我都是溶了又在60度加热10min，不知道这样是不
: 是不好。你用什么方法提RNA？
: 而且我觉得qPCR的误差特别大。相同样品每次做出来都不太一样，biological
: replicates就更没准了，除非差异非常明显。不知道大家有没有同感，还是我个人的问
: 题？
:
: .5
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k****o
发帖数: 589 | 10 乙醇用tip抽走，然后风干5－10分钟，从未出过问题。 |
n****0
发帖数: 696 | 11 做过了，三个在同一板上的technical replicates还可以，如果Ct能在30以下的话。不
过我的确发现有些边缘位置的孔总是和另两个不一样。但是biological replicates就
不行了，同样样品做两次也不一样。这次差5倍，下次差10倍 （relative fold change
），甚至有时趋势还不一样。可能是我提取RNA的问题。因为我要分离tissue，取样品
时间比较长，虽然我都是尽量快速的放到液氮里。几分钟的时间，转录水平会有很大变
化么？
【在 k****o 的大作中提到】
: 乙醇用tip抽走，然后风干5－10分钟，从未出过问题。
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l**********1
发帖数: 5204 | 12 RE: >我的确发现有些边缘位置的孔总是和另两个不一样
of course 96 well plate not all wells have same temperature conditions
during whole qPCR temp
controlling process. So if could avoid those 边缘位置的wells that is better.
change
【在 n****0 的大作中提到】
: 做过了，三个在同一板上的technical replicates还可以，如果Ct能在30以下的话。不
: 过我的确发现有些边缘位置的孔总是和另两个不一样。但是biological replicates就
: 不行了，同样样品做两次也不一样。这次差5倍，下次差10倍 （relative fold change
: ），甚至有时趋势还不一样。可能是我提取RNA的问题。因为我要分离tissue，取样品
: 时间比较长，虽然我都是尽量快速的放到液氮里。几分钟的时间，转录水平会有很大变
: 化么？
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