b******s
发帖数: 1089 | 1 我做三片段连接。entry clone都测过序。但是三片段重组之后总是有一些问题。首先
，每次都有colony。我用不同片段和载体上的primers检测，有时候有些primer组合出
带，有些不出。有时候带还不错，但是size有些移动。最后只好又去测序。有些克隆的
峰乱糟糟叠在一起。有些有clean的峰，但是sequence又不完全match。克隆重复划板，
liquid culture都非常正常。
我一般程序是三片段entry clone加载体每个大约1-1.5ul，LR clonase 1ul，25度反应
18-24h, heat shock之后培养2-3h再涂板。反应和培养时间是否太长？重组反应时间太
长会有问题吗？
另外，我所有的东西都是从同实验室日本博后那要来的。entry clone我自己后来测过
序，但是载体没有。原本来怀疑是载体，就用酶切检测没成功。日本博后告诉我载体是
改造过的，真实序列和他给我的sequence可能不一样。我用几对primers检测，都是对
的。
有经验的能否指教一下可能问题在哪？谢谢 |
b******s
发帖数: 1089 | 2 算了，我给了abstract吧：
multisite gateway为什么colony看起来很正常(spec resistant)，PCR结果不稳定，
sequence结果悲剧？
【在 b******s 的大作中提到】
: 我做三片段连接。entry clone都测过序。但是三片段重组之后总是有一些问题。首先
: ，每次都有colony。我用不同片段和载体上的primers检测，有时候有些primer组合出
: 带，有些不出。有时候带还不错，但是size有些移动。最后只好又去测序。有些克隆的
: 峰乱糟糟叠在一起。有些有clean的峰，但是sequence又不完全match。克隆重复划板，
: liquid culture都非常正常。
: 我一般程序是三片段entry clone加载体每个大约1-1.5ul，LR clonase 1ul，25度反应
: 18-24h, heat shock之后培养2-3h再涂板。反应和培养时间是否太长？重组反应时间太
: 长会有问题吗？
: 另外，我所有的东西都是从同实验室日本博后那要来的。entry clone我自己后来测过
: 序，但是载体没有。原本来怀疑是载体，就用酶切检测没成功。日本博后告诉我载体是
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s********n
发帖数: 2939 | 3 你得到的Clones的sequence是些什么东西？还有就是你的Destination vector的序列正
确吗？ |
i***l
发帖数: 1656 | 4 sequencing all constructs you start with
make sure stuffs are correct at the beginning
【在 b******s 的大作中提到】
: 算了，我给了abstract吧：
: multisite gateway为什么colony看起来很正常(spec resistant)，PCR结果不稳定，
: sequence结果悲剧？
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