v***a
发帖数: 1242 | 1 要overexpress一个蛋白（full length），在NCBI查它的nucleotide sequence来设计
cloning primer，发现有两个看起来都可信的reference sequence，blast了一下，发
现这两个sequence在CDS区有一部分是相同并连贯的，其它就都不同了。其中sequence
1只是cds，并且是partial cds，没有stop codon；sequence 2是complete cds，包括
非CDS区，好像是由NIH MGC (Mammalian Gene Collection) Project来的，但由
sequence 1衍生出的AA序列却比sequence 2衍生的AA序列还要多50多个AA。
我选择了全长的sequence 2设计primer，一共设计了3对，PCR后都未能得到预期bp的
band（虽然有的PCR出来是single band），我每对primer都挑了最接近预期长度的PCR
product去sequence，但都不是我想要的gene。。。难道是sequence 2本身就有问题么
？（我是挑的非CDS区 |
c******r
发帖数: 3778 | 2 这个蛋白很大吗？
如果不是很大，还不如直接从RNA来RT，直接得到coding sequence。
sequence
PCR
的）
【在 v***a 的大作中提到】
: 要overexpress一个蛋白（full length），在NCBI查它的nucleotide sequence来设计
: cloning primer，发现有两个看起来都可信的reference sequence，blast了一下，发
: 现这两个sequence在CDS区有一部分是相同并连贯的，其它就都不同了。其中sequence
: 1只是cds，并且是partial cds，没有stop codon；sequence 2是complete cds，包括
: 非CDS区，好像是由NIH MGC (Mammalian Gene Collection) Project来的，但由
: sequence 1衍生出的AA序列却比sequence 2衍生的AA序列还要多50多个AA。
: 我选择了全长的sequence 2设计primer，一共设计了3对，PCR后都未能得到预期bp的
: band（虽然有的PCR出来是single band），我每对primer都挑了最接近预期长度的PCR
: product去sequence，但都不是我想要的gene。。。难道是sequence 2本身就有问题么
: ？（我是挑的非CDS区
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v***a
发帖数: 1242 | 3 不是很大，2kp不到。我还是不太理解你的意思，能扩展说明一下吗？非常感谢啊！！
【在 c******r 的大作中提到】
: 这个蛋白很大吗？
: 如果不是很大，还不如直接从RNA来RT，直接得到coding sequence。
:
: sequence
: PCR
: 的）
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c******r
发帖数: 3778 | 4 你是说2kb？如果你想表达这个蛋白，很简单啊。设计对primer，提点RNA直接做RT-PCR
好了。这样得到的就是coding sequence，没有intron，表达比较容易吧？
从genomic DNA上clone除了exon还有intron，有时候不一定在细胞里面能够正确表达。
【在 v***a 的大作中提到】
: 不是很大，2kp不到。我还是不太理解你的意思，能扩展说明一下吗？非常感谢啊！！
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v***a
发帖数: 1242 | 5 谢谢。其实我现在的问题就是不知道该如何设计出clone全长coding sequence的primer
，因为sequence 1和sequence 2的cds也不尽相同，而且sequence 1只是partial cds，
无stop codon，而我针对sequence 2设计的primer又总是clone不到我要的gene（其实
我觉得sequence 1可信度较高，所以现在怀疑是不是sequence 2是不确切的）。我现在
想做的就是你的思路，但为难在primer上了。
PCR
【在 c******r 的大作中提到】
: 你是说2kb？如果你想表达这个蛋白，很简单啊。设计对primer，提点RNA直接做RT-PCR
: 好了。这样得到的就是coding sequence，没有intron，表达比较容易吧？
: 从genomic DNA上clone除了exon还有intron，有时候不一定在细胞里面能够正确表达。
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c******r
发帖数: 3778 | 6 。。。没有RNA sequence？
protein叫什么名字？要human的还是mice的？
primer
【在 v***a 的大作中提到】
: 谢谢。其实我现在的问题就是不知道该如何设计出clone全长coding sequence的primer
: ，因为sequence 1和sequence 2的cds也不尽相同，而且sequence 1只是partial cds，
: 无stop codon，而我针对sequence 2设计的primer又总是clone不到我要的gene（其实
: 我觉得sequence 1可信度较高，所以现在怀疑是不是sequence 2是不确切的）。我现在
: 想做的就是你的思路，但为难在primer上了。
:
: PCR
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m******5
发帖数: 1383 | 7 我觉得RNA上RT也不靠谱，如果这个蛋白有多个isoform的话挺麻烦的，到时候结果不好
判断 |
n********k
发帖数: 2818 | 8 pretty easily to deal with that, and if you get the luck, u might even
easily publish a small paper about it along
the cloning...
【在 m******5 的大作中提到】
: 我觉得RNA上RT也不靠谱，如果这个蛋白有多个isoform的话挺麻烦的，到时候结果不好
: 判断
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m*********7
发帖数: 606 | 9 我认为楼主现在要做的不是如何选择哪个sequence，如何设计primer,而是先确定你现
在使用的组织mRNA或cDNA库里这个蛋白是否有表达，表达的isoform是否如sequence 2
所述，否则的话做的都是无用功。
你首先可以在coding region（最好是两个reporting sequence共有的区域）设计
primer扩增300-500bp的片段。这个片段大小很容易扩增，可以很迅速的告诉你此蛋白
是否在你使用的组织mRNA或cDNA库里有表达，是否可以继续使用该材料进行下一步克隆。
如成功的话，再设计两对primer,分别扩增5'-UTR至coding region, 和coding region
至3'-UTR的片段，同样也是300-500bp,这样可以确认该蛋白是否以你所说的sequence 2
的形式表达。如果是的话，再考虑重新设计primer，PCR条件优化，或者扩增两三个800
-1000bp的片段进行拼接。
如果蛋白coding region有表达，而5'-UTR或3'-UTR的扩增未成功，说明该蛋白是以其
他的isoform存在，你需要做5'-RAC |
v***a
发帖数: 1242 | 10 真是非常感谢你！你给的答案就是我想问的！
你所说的前两步我已经做了，所以已知此蛋白表达，并且sequence 2很可能不适用于我
想要得到的组织中的gene。
后来感谢clonebar同学，他帮我查到了一个序列，跟我查到的sequence 1是一致的，并
且有一部分的5'及3' UTR sequence，我刚设计了新的primer，下周到就可以进行实验
了。
我也几乎翻遍了跟我这个gene有关的paper，没有见到有clone full-length的，并且
sequence 2貌似是大家引用最多的（比如设计此gene的siRNA等）。
谢谢你说的5'和3' RACE，这个我没想到，如果sequence 1也不行，我就会采取这个办
法。
非常感谢！！！
2
隆。
region
2
800
【在 m*********7 的大作中提到】
: 我认为楼主现在要做的不是如何选择哪个sequence，如何设计primer,而是先确定你现
: 在使用的组织mRNA或cDNA库里这个蛋白是否有表达，表达的isoform是否如sequence 2
: 所述，否则的话做的都是无用功。
: 你首先可以在coding region（最好是两个reporting sequence共有的区域）设计
: primer扩增300-500bp的片段。这个片段大小很容易扩增，可以很迅速的告诉你此蛋白
: 是否在你使用的组织mRNA或cDNA库里有表达，是否可以继续使用该材料进行下一步克隆。
: 如成功的话，再设计两对primer,分别扩增5'-UTR至coding region, 和coding region
: 至3'-UTR的片段，同样也是300-500bp,这样可以确认该蛋白是否以你所说的sequence 2
: 的形式表达。如果是的话，再考虑重新设计primer，PCR条件优化，或者扩增两三个800
: -1000bp的片段进行拼接。
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m*********7
发帖数: 606 | 11 不客气，希望你能顺利克隆。
还有一个办法你可以试一下，如果你这个蛋白序列比较保守的话，你可以将已知的序列
，如sequence1,去和其他物种（如小鼠，大鼠，黑猩猩）的genome sequence及已知的
cDNA序列比较一下。高度保守的蛋白在较近的物种间coding sequence的exon和intron
间splice的方式很接近，有助于你判断start codon和stop codon的位置。反正你只需
要知道coding region和很小一部分的5'-UTR和3'-UTR的序列，方便克隆就行。
【在 v***a 的大作中提到】
: 真是非常感谢你！你给的答案就是我想问的！
: 你所说的前两步我已经做了，所以已知此蛋白表达，并且sequence 2很可能不适用于我
: 想要得到的组织中的gene。
: 后来感谢clonebar同学，他帮我查到了一个序列，跟我查到的sequence 1是一致的，并
: 且有一部分的5'及3' UTR sequence，我刚设计了新的primer，下周到就可以进行实验
: 了。
: 我也几乎翻遍了跟我这个gene有关的paper，没有见到有clone full-length的，并且
: sequence 2貌似是大家引用最多的（比如设计此gene的siRNA等）。
: 谢谢你说的5'和3' RACE，这个我没想到，如果sequence 1也不行，我就会采取这个办
: 法。
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