w******e
发帖数: 1187 | 1 请大家帮忙看看附件：6个sample加了相同量的radiolabeled RNA aptamer，以及
0/2/5/20/50/100 ug/ml 的target protein，RNA MW ~30kD，protein MW ~200kD，PI
~5.3。用的是6% PAGE gel，没调pH。
主要有两大问题：1. free RNA band（bottom bands）是smear，而且band intensity
非常
低。不知是不是因为gel conc.太低的缘故。
2. 如果只是这一点也就罢了，从RNA-protein complex band应该就能得到kD，可是
0protein
smaple就有两条band，杯具。。。
之后做了点troubleshooting: 1. run了其他两个RNA sample，也都有两条band，所以
不是某一
个sample screw up；2. 怀疑protein-RNA complex没有入胶，改用4%gel（以前做过
staining，free protein 4％ gel之下肯定能入胶），结果和附件基本一样。
上来请教一下：1. 小MW的free RNA的这种band pattern正常吗？能改进吗？2. 有人见
过0
protein sample有"complex band"的情况吗？我还是怀疑protein-RNA complex没入胶
，然后
free RNA somehow也有部分没有入胶，所以superimpose到一起。可是为什么会发生就
没有一点头
绪了。BTW我用同一批sample做过filter binding assay，结果很正常（0protein
background很小，signal随protein conc.而上升直到plateau）。
请牛人指点。多谢！ |
a****k
发帖数: 1130 | 2 我觉得，你要是把自己的实验过程稍微详细点的描述一下，或者大家会比较容易提建议
PI
intensity
【在 w******e 的大作中提到】
: 请大家帮忙看看附件：6个sample加了相同量的radiolabeled RNA aptamer，以及
: 0/2/5/20/50/100 ug/ml 的target protein，RNA MW ~30kD，protein MW ~200kD，PI
: ~5.3。用的是6% PAGE gel，没调pH。
: 主要有两大问题：1. free RNA band（bottom bands）是smear，而且band intensity
: 非常
: 低。不知是不是因为gel conc.太低的缘故。
: 2. 如果只是这一点也就罢了，从RNA-protein complex band应该就能得到kD，可是
: 0protein
: smaple就有两条band，杯具。。。
: 之后做了点troubleshooting: 1. run了其他两个RNA sample，也都有两条band，所以
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I*****y
发帖数: 6402 | 3 RNA probe是怎么做的呀？
PI
intensity
【在 w******e 的大作中提到】
: 请大家帮忙看看附件：6个sample加了相同量的radiolabeled RNA aptamer，以及
: 0/2/5/20/50/100 ug/ml 的target protein，RNA MW ~30kD，protein MW ~200kD，PI
: ~5.3。用的是6% PAGE gel，没调pH。
: 主要有两大问题：1. free RNA band（bottom bands）是smear，而且band intensity
: 非常
: 低。不知是不是因为gel conc.太低的缘故。
: 2. 如果只是这一点也就罢了，从RNA-protein complex band应该就能得到kD，可是
: 0protein
: smaple就有两条band，杯具。。。
: 之后做了点troubleshooting: 1. run了其他两个RNA sample，也都有两条band，所以
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w******e
发帖数: 1187 | 4 能不能说说你指哪些过程？incubation吗？gel loading？
我其实不知道有哪些是关键步骤-_-
谢啦！
【在 a****k 的大作中提到】
: 我觉得，你要是把自己的实验过程稍微详细点的描述一下，或者大家会比较容易提建议
:
: PI
: intensity
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w******e
发帖数: 1187 | 5 RNA: in vitro transcription＋phenol＋Urea PAGE purification＋elutrap＋
column desalt。
radiolabeling：artarctic phosphatase，heat inactivate。PNK＋P32 ATP，
heat inactivate。column purify+desalt
thx!
【在 I*****y 的大作中提到】
: RNA probe是怎么做的呀？
:
: PI
: intensity
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T**********t
发帖数: 1604 | 6 看起来像是RNA没跑进胶里的缘故，你的sample buffer和running buffer是什么，会不
会RNA的电荷被中和了跑不动啊？30kD用4%的胶应该肯定能跑进去没问题。
而且为什么你的sample不管是upper band还是bottom band，看起来从左到右都有增加
的趋势？我没做过同位素标记的胶，不知道是不是曝光或者聚焦哪里有不对还是怎么回
事。 |
w******e
发帖数: 1187 | 7 sample buffer: PBS+DNA loading buffer; running buffer: TBE.
我平时run cold RNA都是用这个buffer system没出过问题，不过平时用的gel都是
10％ premade gel，room temperature，还是有点不太一样。
upper band有增加我觉得是complex增加的缘故（不考虑极高background的话能fit出
Kd-_-），bottom band确实不应该，我也不知为啥。。。
【在 T**********t 的大作中提到】
: 看起来像是RNA没跑进胶里的缘故，你的sample buffer和running buffer是什么，会不
: 会RNA的电荷被中和了跑不动啊？30kD用4%的胶应该肯定能跑进去没问题。
: 而且为什么你的sample不管是upper band还是bottom band，看起来从左到右都有增加
: 的趋势？我没做过同位素标记的胶，不知道是不是曝光或者聚焦哪里有不对还是怎么回
: 事。
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T**********t
发帖数: 1604 | 8 我们实验室跑native gel用的都是Tris-Glycine buffer，用TBE跑不动，我也不知道原
因，但是TBE就是跑不动。
upper band强度增加是应该的，但是bottom band应该相应减弱才对。因为你每个孔加
的RNA量是一样的，所以上下band的强度加起来应该是恒定的。你每次跑这个胶都会这
样么？
【在 w******e 的大作中提到】
: sample buffer: PBS+DNA loading buffer; running buffer: TBE.
: 我平时run cold RNA都是用这个buffer system没出过问题，不过平时用的gel都是
: 10％ premade gel，room temperature，还是有点不太一样。
:
: upper band有增加我觉得是complex增加的缘故（不考虑极高background的话能fit出
: Kd-_-），bottom band确实不应该，我也不知为啥。。。
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a****k
发帖数: 1130 | 9 30kD的话那你的RNA probe大概有100nt左右了吧？根据我自己的经验，100nt的RNA再加
上个200kD的蛋白，是很难跑进6%的acrylamide gel的，所以要是我的话一般会选择用
agarose gel。还有看起来你的sample是蛋白加的越多band就越强，我怀疑是不是你的
incubation buffer有RNase能degrade你的probe，然后很有可能你的蛋白本身能bind
probe，所以蛋白加多了也就保护了RNA
【在 w******e 的大作中提到】
: 能不能说说你指哪些过程？incubation吗？gel loading？
: 我其实不知道有哪些是关键步骤-_-
: 谢啦！
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w******e
发帖数: 1187 | 10 bottom band不是每次都强，而是比较random-_-我只run了两三块gel，没发现
bottom band有什么规律。。。
这个还真没想到。。。回头试试看。谢啦！
【在 T**********t 的大作中提到】
: 我们实验室跑native gel用的都是Tris-Glycine buffer，用TBE跑不动，我也不知道原
: 因，但是TBE就是跑不动。
: upper band强度增加是应该的，但是bottom band应该相应减弱才对。因为你每个孔加
: 的RNA量是一样的，所以上下band的强度加起来应该是恒定的。你每次跑这个胶都会这
: 样么？
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w******e
发帖数: 1187 | 11
多谢！我最初的想法是我run free protein都能入胶，加上RNA应该更方便，不过也许
未必。用agarose gel能做radio吗？PAGE毕竟是把胶封在玻璃板里，不用太担心
P32 contaminate gel casette。
我的RNA是2'-F modified，通常没有degradation的问题。
and最后的最后，我还是不明白为啥0protein有upper band。现在只能想到好死不死
用我的system free RNA就不入胶。。。
【在 a****k 的大作中提到】
: 30kD的话那你的RNA probe大概有100nt左右了吧？根据我自己的经验，100nt的RNA再加
: 上个200kD的蛋白，是很难跑进6%的acrylamide gel的，所以要是我的话一般会选择用
: agarose gel。还有看起来你的sample是蛋白加的越多band就越强，我怀疑是不是你的
: incubation buffer有RNase能degrade你的probe，然后很有可能你的蛋白本身能bind
: probe，所以蛋白加多了也就保护了RNA
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T**********t
发帖数: 1604 | 12 你做同位素的胶应该有一套dedicated的gel apparatus吧。。。你老板现在有钱，让他
给买！
【在 w******e 的大作中提到】
:
: 多谢！我最初的想法是我run free protein都能入胶，加上RNA应该更方便，不过也许
: 未必。用agarose gel能做radio吗？PAGE毕竟是把胶封在玻璃板里，不用太担心
: P32 contaminate gel casette。
: 我的RNA是2'-F modified，通常没有degradation的问题。
: and最后的最后，我还是不明白为啥0protein有upper band。现在只能想到好死不死
: 用我的system free RNA就不入胶。。。
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a****k
发帖数: 1130 | 13 可以做，不过我们一般会单独拿一个casette出来专门run radio的。
如果你一定要用玻璃板，其实我们也试着把agarose配进PAGE里面，不过这样胶会比较
沉，很容易从两层玻璃间漏出去。所以建议用磨砂玻璃板配胶
还有那个size的RNA run 6%的denature gel是肯定不会出现upper band的，所以我在想
或许是有什么secondery structure形成吧，比较你的probe也是经过gel purify的了，
应该不会有别的问题。还是换一个running system吧
【在 w******e 的大作中提到】
:
: 多谢！我最初的想法是我run free protein都能入胶，加上RNA应该更方便，不过也许
: 未必。用agarose gel能做radio吗？PAGE毕竟是把胶封在玻璃板里，不用太担心
: P32 contaminate gel casette。
: 我的RNA是2'-F modified，通常没有degradation的问题。
: and最后的最后，我还是不明白为啥0protein有upper band。现在只能想到好死不死
: 用我的system free RNA就不入胶。。。
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w******e
发帖数: 1187 | 14 我们PAGE system是有专做radio的，别人做gel shift都用PAGE没问题，就我比较
衰（当然别人做的都是DNA，挺多步骤不太一样）。
我先试试换buffer成不成吧。多谢啦！
【在 T**********t 的大作中提到】
: 你做同位素的胶应该有一套dedicated的gel apparatus吧。。。你老板现在有钱，让他
: 给买！
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w******e
发帖数: 1187 | 15 嗯，多谢几位的建议！我要是有好消息回头给大家update一下呵呵。
【在 a****k 的大作中提到】
: 可以做，不过我们一般会单独拿一个casette出来专门run radio的。
: 如果你一定要用玻璃板，其实我们也试着把agarose配进PAGE里面，不过这样胶会比较
: 沉，很容易从两层玻璃间漏出去。所以建议用磨砂玻璃板配胶
: 还有那个size的RNA run 6%的denature gel是肯定不会出现upper band的，所以我在想
: 或许是有什么secondery structure形成吧，比较你的probe也是经过gel purify的了，
: 应该不会有别的问题。还是换一个running system吧
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a********n
发帖数: 844 | 16 如果lz在讲附上的胶，我的看法是：
1.上面那个带是well里边滞留的，下面那个是free CTP还是free RNA不好说。但整个胶
曝光时间不够长。我做过无数EMSA，也是RNA aptamer，RNA 从MAXIscript得到后不用
纯化，直接取1 ul去跑denaturing gel，看看有没有transcripts，产量有可能因为变
化的，所以每批都要检验。我组里有个博后不信邪，在这上面浪费了几个星期，一直以
为是这个那个仪器不好用。
2.lz提到protine minus也有多条带，这在native gel里边太正常了，因为RNA有多种
folding的可能性，即使mfold只给出一种结构，我在胶里也能看到很多条带。蛋白特异
性的带可能跟RNA一下带superimpose，但是你会看到下边一条带变弱，上面一条带变强
，这样你要换种浓度的胶跑跑。
3.制胶和电泳液可以用1/4xTBE或者1/2xTGB，前者我用的比较多，这个每个蛋白性质有
关，一般都要试试。
4.ARGA胶有些时候可以替代page，想B52的RNA APTAMER只能在ARGA胶才能看到shift，
原因不明。 |
a********n
发帖数: 844 | 17 BTW，原来lz是标记RNA，我用的是internal labeling，省事多了，一个in vitro
transcription就搞定，不要照搬label DNA 那一套 |
w******e
发帖数: 1187 | 18 internal labeling是指用比如带biotin的NTP做in vitro xcription吗？
如果是，用哪种NTP呢？麻烦展开说说：）
【在 a********n 的大作中提到】
: BTW，原来lz是标记RNA，我用的是internal labeling，省事多了，一个in vitro
: transcription就搞定，不要照搬label DNA 那一套
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w******e
发帖数: 1187 | 19 又遇到行家了，多谢啊！多问几个问题呵呵
我的RNA都做过PAGE purification，产物方面应该没问题。
你说free CTP我没理解。看你下一个回复，是不是不用radio用的其他方法？
嗯我也听说过这种情况但自己没见过。不知道出现这种情况的时候怎么计算percentage
of bound RNA呢？把所有band加起来作为total？另外，怎么说服别人某个band是
complex band其他都是free RNA呢？
第二次被提醒buffer的问题了。一定要试试。多谢！
真没用过这个。多谢建议。
【在 a********n 的大作中提到】
: 如果lz在讲附上的胶，我的看法是：
: 1.上面那个带是well里边滞留的，下面那个是free CTP还是free RNA不好说。但整个胶
: 曝光时间不够长。我做过无数EMSA，也是RNA aptamer，RNA 从MAXIscript得到后不用
: 纯化，直接取1 ul去跑denaturing gel，看看有没有transcripts，产量有可能因为变
: 化的，所以每批都要检验。我组里有个博后不信邪，在这上面浪费了几个星期，一直以
: 为是这个那个仪器不好用。
: 2.lz提到protine minus也有多条带，这在native gel里边太正常了，因为RNA有多种
: folding的可能性，即使mfold只给出一种结构，我在胶里也能看到很多条带。蛋白特异
: 性的带可能跟RNA一下带superimpose，但是你会看到下边一条带变弱，上面一条带变强
: ，这样你要换种浓度的胶跑跑。
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a********n
发帖数: 844 | 20 用alpha-CTP，不是gamma-ATP,alpha-UTP也行，不过差点。
RNA in vitro transcription 用Applied biosystems的Maxiscript足矣
biotin没有试过，下来准备试试，可以避免用同位素。 |
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a********n
发帖数: 844 | 21 多条带的情况下如果要做binding curve，建议用filter-binding assay,默认有几个高
蛋白浓度intensity不变，证明所有RNA都结合蛋白被滞留在filter上，所以那个total
RNA,其他浓度下的intensity都除以这个高浓度的。
有个paper里可以见到你碰到的多条带问题，和两种不同的胶和不同的buffer，给你发
邮件。 |
w******e
发帖数: 1187 | 22 明白了。好奇问一下，如果xcription时就加radio的话，你们接下来的
phenol/PAGE/elute都在radio room里做吗？感觉确实有点吓人呵呵。
不过这样每个xcript有多个radio label，intensity一定够了：）
遗憾我要用2'-F pyrimidine，只能用epicenture的kit。还是要多谢推荐！
【在 a********n 的大作中提到】
: 用alpha-CTP，不是gamma-ATP,alpha-UTP也行，不过差点。
: RNA in vitro transcription 用Applied biosystems的Maxiscript足矣
: biotin没有试过，下来准备试试，可以避免用同位素。
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w******e
发帖数: 1187 | 23 我用filter binding 做过一次了，老板非要用其他方法confirm。。。
and我filter binding做出来的protein bound RNA plateau时只有20％，怀疑是
aptamer有多种conformation，不过也是老板不爽的原因呵呵。
total
非常感谢！
【在 a********n 的大作中提到】
: 多条带的情况下如果要做binding curve，建议用filter-binding assay,默认有几个高
: 蛋白浓度intensity不变，证明所有RNA都结合蛋白被滞留在filter上，所以那个total
: RNA,其他浓度下的intensity都除以这个高浓度的。
: 有个paper里可以见到你碰到的多条带问题，和两种不同的胶和不同的buffer，给你发
: 邮件。
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a********n
发帖数: 844 | 24 所以说不要胶纯化radioactive RNA,创造太多机会污染实验室了。我们几年来就在实验
室里边一个公用实验台做radioactive的东西，没有发生污染，连专用的高速离心机都
不需要，就需要一个小小的甩甩管壁上的东西。filter binding的前提是EMSA没问题，
有特意的带，你得把EMSA做出正常的结果才行。 |
w******e
发帖数: 1187 | 25 明白了。多谢建议！：）
【在 a********n 的大作中提到】
: 所以说不要胶纯化radioactive RNA,创造太多机会污染实验室了。我们几年来就在实验
: 室里边一个公用实验台做radioactive的东西，没有发生污染，连专用的高速离心机都
: 不需要，就需要一个小小的甩甩管壁上的东西。filter binding的前提是EMSA没问题，
: 有特意的带，你得把EMSA做出正常的结果才行。
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w******e
发帖数: 1187 | 26 update一下，根据版上几位铜锈的意见换了buffer，果然以前probe都没有入胶（
still don't know why though, as I use 1XTBE all the time)，然后很ft的
发现protein target要加到上百nM才能看到shift，然后成linear上升-_-
最后换了SPR，结果跟filter binding一致，low nM Kd。但是EMSA为什么没
work还是不清楚，急着wrap up project也就没多试其他buffer/gel system
【在 w******e 的大作中提到】
: 明白了。多谢建议！：）
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T**********t
发帖数: 1604 | 27 SPR能confirm就行了。
我是SPR没法confirm结果去做了ITC的。:D
【在 w******e 的大作中提到】
: update一下，根据版上几位铜锈的意见换了buffer，果然以前probe都没有入胶（
: still don't know why though, as I use 1XTBE all the time)，然后很ft的
: 发现protein target要加到上百nM才能看到shift，然后成linear上升-_-
: 最后换了SPR，结果跟filter binding一致，low nM Kd。但是EMSA为什么没
: work还是不清楚，急着wrap up project也就没多试其他buffer/gel system
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