由买买提看人间百态

boards

本页内容为未名空间相应帖子的节选和存档,一周内的贴子最多显示50字,超过一周显示500字 访问原贴
Biology版 - RNA电泳前需要热变性,为何随后需要冰上冷却后再电泳?
相关主题
问问直接用PCR product+ T7 promoter invitro transcript做探针的同学有人用过BULLET BLENDER来homogenize tissue吗?
便宜的和贵的药品差别大吗Re: 问题:关于RNase
学生物的都来看下哈~zzRe: Who knows about RNase H? --- ask for help!
裂解yeast的仪器Re: RNA extraction
谁跑总RNA变性胶碰到过这种奇异怪事?有人用rna later么
EMSA再次求教——0 protein也有”complex band"。。。一个冷笑话 (zz)
Help me !!!DNase I hypersensitive assayPlease help: in vitro transcription problem.
关于denaturing和 non-denaturing DNA gel【求助】PCR为什么目的基因有,但S16基因就几乎看不到?
相关话题的讨论汇总
话题: rna话题: 电泳话题: 冰上话题: 变性话题: 复性
进入Biology版参与讨论
1 (共1页)
v********a
发帖数: 646
1
做rna很久了,一直没有明白这个道理。
无论是化学合成的rna,还是从组织提取的rna,
无论是从-80冰箱刚拿出来的,还是新鲜制备的rna
在跑PAGE之前,需要先热变性,去除RNA高级结构。这个很好理解。
问题是:为何所有的paper上,都将热变性的RNA冰上孵育后再电泳?
v**********m
发帖数: 5516
2
在变性剂里加热?那就是为了完全变性,去除高级结构干扰电泳结果。

【在 v********a 的大作中提到】
: 做rna很久了,一直没有明白这个道理。
: 无论是化学合成的rna,还是从组织提取的rna,
: 无论是从-80冰箱刚拿出来的,还是新鲜制备的rna
: 在跑PAGE之前,需要先热变性,去除RNA高级结构。这个很好理解。
: 问题是:为何所有的paper上,都将热变性的RNA冰上孵育后再电泳?

r*******0
发帖数: 4
3
正解,变性去结构。
v********a
发帖数: 646
4

这个我知道,但是冷却后,按道理应该复性了啊!

【在 v**********m 的大作中提到】
: 在变性剂里加热?那就是为了完全变性,去除高级结构干扰电泳结果。
v**********m
发帖数: 5516
5
样品在什么溶液里?

【在 v********a 的大作中提到】
:
: 这个我知道,但是冷却后,按道理应该复性了啊!

e**e
发帖数: 614
6
甲醛或乙二醛分子与RNA分子结合使得其不能复性
S*****r
发帖数: 139
7
试一下,你会发现不放冰上也没事

【在 v********a 的大作中提到】
: 做rna很久了,一直没有明白这个道理。
: 无论是化学合成的rna,还是从组织提取的rna,
: 无论是从-80冰箱刚拿出来的,还是新鲜制备的rna
: 在跑PAGE之前,需要先热变性,去除RNA高级结构。这个很好理解。
: 问题是:为何所有的paper上,都将热变性的RNA冰上孵育后再电泳?

v********a
发帖数: 646
8

就是普通的TBE-Urea PAGE Loading buffer 里面。

【在 v**********m 的大作中提到】
: 样品在什么溶液里?
v**********m
发帖数: 5516
9
urea是变性剂,冷却后不能复性。
RNA复性通常在生理条件加Mg离子。

【在 v********a 的大作中提到】
:
: 就是普通的TBE-Urea PAGE Loading buffer 里面。

K******S
发帖数: 10109
10
heat --> ice cold (stays denatured)
vs
heat --> gradually cool down (might 复性)

【在 v********a 的大作中提到】
:
: 就是普通的TBE-Urea PAGE Loading buffer 里面。

相关主题
EMSA再次求教——0 protein也有”complex band"。。。有人用过BULLET BLENDER来homogenize tissue吗?
Help me !!!DNase I hypersensitive assayRe: 问题:关于RNase
关于denaturing和 non-denaturing DNA gelRe: Who knows about RNase H? --- ask for help!
进入Biology版参与讨论
b****r
发帖数: 17995
11
我觉得好多国人就是喜欢偷工减料
估计绝大部分时候是没事,但是偶尔结构特殊的,不放冰上可能差别很大,你错了都不
知道

【在 S*****r 的大作中提到】
: 试一下,你会发现不放冰上也没事
v**********m
发帖数: 5516
12
这里有RNase潜在污染的问题,放冰上比较安全。
RNase热稳定性极佳。

【在 b****r 的大作中提到】
: 我觉得好多国人就是喜欢偷工减料
: 估计绝大部分时候是没事,但是偶尔结构特殊的,不放冰上可能差别很大,你错了都不
: 知道

S*****r
发帖数: 139
13
以前可能比较少,现在做反应都加RNAase inhibitor的吧,有点贵不过用的也很少

【在 v**********m 的大作中提到】
: 这里有RNase潜在污染的问题,放冰上比较安全。
: RNase热稳定性极佳。

S*****r
发帖数: 139
14
前几次肯定照protocol,但protocol并不是不可逾越的法律,lz多试试就知道差别大不
大了,差别大了再找原因。
能节省一点体力时间当然是有益的,跑个上百孔的shark teeth很累的。

【在 b****r 的大作中提到】
: 我觉得好多国人就是喜欢偷工减料
: 估计绝大部分时候是没事,但是偶尔结构特殊的,不放冰上可能差别很大,你错了都不
: 知道

b****r
发帖数: 17995
15
同样的标本,做了validation再改当然不一样,不过他说的是 要人家不放冰上,说会
一样的

【在 S*****r 的大作中提到】
: 前几次肯定照protocol,但protocol并不是不可逾越的法律,lz多试试就知道差别大不
: 大了,差别大了再找原因。
: 能节省一点体力时间当然是有益的,跑个上百孔的shark teeth很累的。

v********a
发帖数: 646
16

我们的RNA都是经过化学修饰的,加入酶,也不会降解。
所以不懂为何变性之后立即置于冰上。

【在 b****r 的大作中提到】
: 我觉得好多国人就是喜欢偷工减料
: 估计绝大部分时候是没事,但是偶尔结构特殊的,不放冰上可能差别很大,你错了都不
: 知道

h*******o
发帖数: 4884
17
缓慢冷却可能会导致部分复性
这个生化基础上面应该提到过, 对于western也是同样的道理

【在 v********a 的大作中提到】
:
: 我们的RNA都是经过化学修饰的,加入酶,也不会降解。
: 所以不懂为何变性之后立即置于冰上。

C*****5
发帖数: 8812
18
我觉得你其实也没搞清楚为什么要放冰上, 就在这里敢指责“国人”了。你自己不也
是个人云亦云的糊涂蛋吗。照着protocol走是没错,但是也要想想为啥吧?这样做科研
是没出息的。本来做生物就难出头了,再加上这种态度。早点改行吧。

【在 b****r 的大作中提到】
: 我觉得好多国人就是喜欢偷工减料
: 估计绝大部分时候是没事,但是偶尔结构特殊的,不放冰上可能差别很大,你错了都不
: 知道

f*******e
发帖数: 628
19
前面好几个人都给了正解了。Snap cool 能够保持 heat denatured RNA 维持
denatured 的状态。如果你的 buffer 不是 low salt, 这一步骤非常重要。

【在 v********a 的大作中提到】
:
: 我们的RNA都是经过化学修饰的,加入酶,也不会降解。
: 所以不懂为何变性之后立即置于冰上。

1 (共1页)
进入Biology版参与讨论
相关主题
【求助】PCR为什么目的基因有,但S16基因就几乎看不到?谁跑总RNA变性胶碰到过这种奇异怪事?
如何绝对定量mRNA拷贝数?EMSA再次求教——0 protein也有”complex band"。。。
plasma只占whole blood的一小半?Help me !!!DNase I hypersensitive assay
用Formalin fix过的细胞提RNA然后作microarray会有问题么?关于denaturing和 non-denaturing DNA gel
问问直接用PCR product+ T7 promoter invitro transcript做探针的同学有人用过BULLET BLENDER来homogenize tissue吗?
便宜的和贵的药品差别大吗Re: 问题:关于RNase
学生物的都来看下哈~zzRe: Who knows about RNase H? --- ask for help!
裂解yeast的仪器Re: RNA extraction
相关话题的讨论汇总
话题: rna话题: 电泳话题: 冰上话题: 变性话题: 复性