v********a 发帖数: 646 | 1 做rna很久了,一直没有明白这个道理。
无论是化学合成的rna,还是从组织提取的rna,
无论是从-80冰箱刚拿出来的,还是新鲜制备的rna
在跑PAGE之前,需要先热变性,去除RNA高级结构。这个很好理解。
问题是:为何所有的paper上,都将热变性的RNA冰上孵育后再电泳? |
v**********m 发帖数: 5516 | 2 在变性剂里加热?那就是为了完全变性,去除高级结构干扰电泳结果。
【在 v********a 的大作中提到】 : 做rna很久了,一直没有明白这个道理。 : 无论是化学合成的rna,还是从组织提取的rna, : 无论是从-80冰箱刚拿出来的,还是新鲜制备的rna : 在跑PAGE之前,需要先热变性,去除RNA高级结构。这个很好理解。 : 问题是:为何所有的paper上,都将热变性的RNA冰上孵育后再电泳?
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r*******0 发帖数: 4 | |
v********a 发帖数: 646 | 4
这个我知道,但是冷却后,按道理应该复性了啊!
【在 v**********m 的大作中提到】 : 在变性剂里加热?那就是为了完全变性,去除高级结构干扰电泳结果。
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v**********m 发帖数: 5516 | 5 样品在什么溶液里?
【在 v********a 的大作中提到】 : : 这个我知道,但是冷却后,按道理应该复性了啊!
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e**e 发帖数: 614 | |
S*****r 发帖数: 139 | 7 试一下,你会发现不放冰上也没事
【在 v********a 的大作中提到】 : 做rna很久了,一直没有明白这个道理。 : 无论是化学合成的rna,还是从组织提取的rna, : 无论是从-80冰箱刚拿出来的,还是新鲜制备的rna : 在跑PAGE之前,需要先热变性,去除RNA高级结构。这个很好理解。 : 问题是:为何所有的paper上,都将热变性的RNA冰上孵育后再电泳?
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v********a 发帖数: 646 | 8
就是普通的TBE-Urea PAGE Loading buffer 里面。
【在 v**********m 的大作中提到】 : 样品在什么溶液里?
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v**********m 发帖数: 5516 | 9 urea是变性剂,冷却后不能复性。
RNA复性通常在生理条件加Mg离子。
【在 v********a 的大作中提到】 : : 就是普通的TBE-Urea PAGE Loading buffer 里面。
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K******S 发帖数: 10109 | 10 heat --> ice cold (stays denatured)
vs
heat --> gradually cool down (might 复性)
【在 v********a 的大作中提到】 : : 就是普通的TBE-Urea PAGE Loading buffer 里面。
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b****r 发帖数: 17995 | 11 我觉得好多国人就是喜欢偷工减料
估计绝大部分时候是没事,但是偶尔结构特殊的,不放冰上可能差别很大,你错了都不
知道
【在 S*****r 的大作中提到】 : 试一下,你会发现不放冰上也没事
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v**********m 发帖数: 5516 | 12 这里有RNase潜在污染的问题,放冰上比较安全。
RNase热稳定性极佳。
【在 b****r 的大作中提到】 : 我觉得好多国人就是喜欢偷工减料 : 估计绝大部分时候是没事,但是偶尔结构特殊的,不放冰上可能差别很大,你错了都不 : 知道
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S*****r 发帖数: 139 | 13 以前可能比较少,现在做反应都加RNAase inhibitor的吧,有点贵不过用的也很少
【在 v**********m 的大作中提到】 : 这里有RNase潜在污染的问题,放冰上比较安全。 : RNase热稳定性极佳。
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S*****r 发帖数: 139 | 14 前几次肯定照protocol,但protocol并不是不可逾越的法律,lz多试试就知道差别大不
大了,差别大了再找原因。
能节省一点体力时间当然是有益的,跑个上百孔的shark teeth很累的。
【在 b****r 的大作中提到】 : 我觉得好多国人就是喜欢偷工减料 : 估计绝大部分时候是没事,但是偶尔结构特殊的,不放冰上可能差别很大,你错了都不 : 知道
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b****r 发帖数: 17995 | 15 同样的标本,做了validation再改当然不一样,不过他说的是 要人家不放冰上,说会
一样的
【在 S*****r 的大作中提到】 : 前几次肯定照protocol,但protocol并不是不可逾越的法律,lz多试试就知道差别大不 : 大了,差别大了再找原因。 : 能节省一点体力时间当然是有益的,跑个上百孔的shark teeth很累的。
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v********a 发帖数: 646 | 16
我们的RNA都是经过化学修饰的,加入酶,也不会降解。
所以不懂为何变性之后立即置于冰上。
【在 b****r 的大作中提到】 : 我觉得好多国人就是喜欢偷工减料 : 估计绝大部分时候是没事,但是偶尔结构特殊的,不放冰上可能差别很大,你错了都不 : 知道
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h*******o 发帖数: 4884 | 17 缓慢冷却可能会导致部分复性
这个生化基础上面应该提到过, 对于western也是同样的道理
【在 v********a 的大作中提到】 : : 我们的RNA都是经过化学修饰的,加入酶,也不会降解。 : 所以不懂为何变性之后立即置于冰上。
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C*****5 发帖数: 8812 | 18 我觉得你其实也没搞清楚为什么要放冰上, 就在这里敢指责“国人”了。你自己不也
是个人云亦云的糊涂蛋吗。照着protocol走是没错,但是也要想想为啥吧?这样做科研
是没出息的。本来做生物就难出头了,再加上这种态度。早点改行吧。
【在 b****r 的大作中提到】 : 我觉得好多国人就是喜欢偷工减料 : 估计绝大部分时候是没事,但是偶尔结构特殊的,不放冰上可能差别很大,你错了都不 : 知道
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f*******e 发帖数: 628 | 19 前面好几个人都给了正解了。Snap cool 能够保持 heat denatured RNA 维持
denatured 的状态。如果你的 buffer 不是 low salt, 这一步骤非常重要。
【在 v********a 的大作中提到】 : : 我们的RNA都是经过化学修饰的,加入酶,也不会降解。 : 所以不懂为何变性之后立即置于冰上。
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