p****z
发帖数: 31 | 1 最近直接用1*SDS sample buffer溶解细胞，煮10分钟，13K rpm离心后，在液体表面老
是会有一层白色的不溶物，试过用超声破碎，没效果，打散之后，重新离心还是那样。
换过SDS sample buffer也还是会这样。试图吸出来，一弄就散，然后和溶液混在一起
。细胞在加裂解液之前都有用 PBS洗过。如果样品就这样加进去，会导致vertical
streaking，有时候50kD 以下的lane会连在一起。有人知道这是什么状况吗？或者有可
能是哪些问题？谢谢赐教！ |
c******m
发帖数: 884 | 2 which type of cell are you using? |
p****z
发帖数: 31 | 3 H1299, lung cancer cell line
【在 c******m 的大作中提到】
: which type of cell are you using?
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c******m
发帖数: 884 | 4 没用过这种细胞啊。你试试不吸表层的白色不溶物，而是小心地把下层lysate吸出来。 |
s******s
发帖数: 13035 | 5 如果不是很sensitive的assay,试着用0.1%的triton一类
homogenize以后过0.2um的filter
【在 p****z 的大作中提到】
: 最近直接用1*SDS sample buffer溶解细胞，煮10分钟，13K rpm离心后，在液体表面老
: 是会有一层白色的不溶物，试过用超声破碎，没效果，打散之后，重新离心还是那样。
: 换过SDS sample buffer也还是会这样。试图吸出来，一弄就散，然后和溶液混在一起
: 。细胞在加裂解液之前都有用 PBS洗过。如果样品就这样加进去，会导致vertical
: streaking，有时候50kD 以下的lane会连在一起。有人知道这是什么状况吗？或者有可
: 能是哪些问题？谢谢赐教！
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p****z
发帖数: 31 | 6 我也就是这几次出现这种情况，也试过只吸下层，还是不行。比如说取100ul，吸到
50ul左右的时候，就会发现白色的不容物也开始一起被吸进去。这东西很奇怪，很容易
和样品混在一起。
【在 c******m 的大作中提到】
: 没用过这种细胞啊。你试试不吸表层的白色不溶物，而是小心地把下层lysate吸出来。
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p****z
发帖数: 31 | 7 主要是用来做western，过滤会不会导致某些蛋白的减少？
【在 s******s 的大作中提到】
: 如果不是很sensitive的assay,试着用0.1%的triton一类
: homogenize以后过0.2um的filter
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W****7
发帖数: 426 | 8 估计是礼品lipid一类的东西，我做脂肪细胞的时候遇到这种情况太多了，只能多离心
几次，分几次取出来不能怕麻烦。过滤器也是个好办法，不过你样品很少的话过滤器就
不行了，基本上都损失掉了！过滤器后的样品我做过100-200kD的蛋白大体上都没有什
么问题。 |
h*******0
发帖数: 48 | 9 应该是核酸，多加点buffer稀释，理想脑后去上清就行了 |
j*****a
发帖数: 658 | 10 我猜也是核酸。我也有这样的一层白色，不过不是在上层，离心后在下层（最大速度几
秒钟）。上样的
时候我一般避免吸这层白膜，我觉得是要么是核酸要么是debris。总之都不是我要的收
集的蛋白。
【在 h*******0 的大作中提到】
: 应该是核酸，多加点buffer稀释，理想脑后去上清就行了
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p****z
发帖数: 31 | 11 我的是高速离心后在上面，貌试离不下来。如果是核酸的话，为什么超声没有用？
【在 j*****a 的大作中提到】
: 我猜也是核酸。我也有这样的一层白色，不过不是在上层，离心后在下层（最大速度几
: 秒钟）。上样的
: 时候我一般避免吸这层白膜，我觉得是要么是核酸要么是debris。总之都不是我要的收
: 集的蛋白。
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z*******a
发帖数: 175 | 12
i would try
sonicate in 2 x sample buffer and vortex every 2min intervals during
boiling
【在 p****z 的大作中提到】
: 最近直接用1*SDS sample buffer溶解细胞，煮10分钟，13K rpm离心后，在液体表面老
: 是会有一层白色的不溶物，试过用超声破碎，没效果，打散之后，重新离心还是那样。
: 换过SDS sample buffer也还是会这样。试图吸出来，一弄就散，然后和溶液混在一起
: 。细胞在加裂解液之前都有用 PBS洗过。如果样品就这样加进去，会导致vertical
: streaking，有时候50kD 以下的lane会连在一起。有人知道这是什么状况吗？或者有可
: 能是哪些问题？谢谢赐教！
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