c*******7
发帖数: 28 | 1 在尝试用FACS区分表达EGFP／RFP的两种细胞,希望最后能统计出两者的ratio
但是奇怪的是,EGFP在FL1,FL2两个通道的分布几乎完全相同,不能区分
用的是pEGFP-C1载体,EGFP在N端,无插入序列,共聚焦显微镜下表达正常,用红色荧光通
道无法检测到
转293T cell，没有做任何固定,仅用PBS重悬
同时看了RFP或者mcherry,就可以用FL2通道检测,在FL1上信号很弱,可以区分出来
想问一下大家有没有遇到这样的情况?这是质粒本身的问题还是机器调试的问题? |
c******r
发帖数: 3778 | 2 你有没有controls？就是说只有GFP和只有RFP的细胞？看起来什么样子？最好给个截图
看一眼。 |
m*********7
发帖数: 5207 | 3 查看一下你机器里FL2通道的设置，是不是波长在GFP和RFP之间？ |
c*******7
发帖数: 28 | 4 我说的就是单荧光的control，还没有把两种荧光混起来。
我把RFP和EGFP的结果上传了。EGFP那张图最后用FL1,FL2作为纵横坐标作图,结果就几
乎是一条直线。
机器是BD FACSCalibur Flow Cytometry System
【在 c******r 的大作中提到】
: 你有没有controls？就是说只有GFP和只有RFP的细胞？看起来什么样子？最好给个截图
: 看一眼。
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c******r
发帖数: 3778 | 5 你有compensate？最后这个是compensate之前还是之后的？
【在 c*******7 的大作中提到】
: 我说的就是单荧光的control，还没有把两种荧光混起来。
: 我把RFP和EGFP的结果上传了。EGFP那张图最后用FL1,FL2作为纵横坐标作图,结果就几
: 乎是一条直线。
: 机器是BD FACSCalibur Flow Cytometry System
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c*******7
发帖数: 28 | 6
【在 c******r 的大作中提到】
: 你有compensate？最后这个是compensate之前还是之后的？
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c******r
发帖数: 3778 | 7 compensate应该有至少两套图吧？
一套是GFP的，四张图，只有FL1有positive staining
一套是RFP的，四张图，只有FL2有positive staining
你这两套图看着像GFP和negative control的，没有RFP的？
【在 c*******7 的大作中提到】
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c*******7
发帖数: 28 | 8 RFP和GFP在4楼贴了
最后两张都是negative control,贴重复了
【在 c******r 的大作中提到】
: compensate应该有至少两套图吧？
: 一套是GFP的，四张图，只有FL1有positive staining
: 一套是RFP的，四张图，只有FL2有positive staining
: 你这两套图看着像GFP和negative control的，没有RFP的？
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c******r
发帖数: 3778 | 9 哦，好像RFP问题不大？主要是GFP的fl1 leak到fl2了，你compensate了多少？
几种可能性：
1. 设置有问题。
2. 细胞本身有问题，比如会不会这个细胞已经有了RFP？
3. autofluorescent。那么这个细胞系也许不适合这个实验？
【在 c*******7 的大作中提到】
: RFP和GFP在4楼贴了
: 最后两张都是negative control,贴重复了
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