i********e
发帖数: 50 | 1 有个超大蛋白，单体为550Kda, 细胞里是tetramer。想看一下转基因表达后的状态，是
monomer/dimer/tetramer.请问除了native page还有什么方法能够鉴别或者比较
monomer/tetramer？
native page用了basic-native gel protocol。做western blot的话，使用的抗体和
monomer或tetramer结合的效果会有差异吗？比如monomer的结合效果好，band清晰。抗
体和tetramer 反应弱，看不大出来band?
比较奇怪的是，6％的胶跑3个小时和6个小时的结果不一样。难道6个小时后所有的蛋白
跑出去了？不应该啊.
求高人指点。 |
a****k
发帖数: 1130 | 2 可以run gel filtration column
【在 i********e 的大作中提到】
: 有个超大蛋白，单体为550Kda, 细胞里是tetramer。想看一下转基因表达后的状态，是
: monomer/dimer/tetramer.请问除了native page还有什么方法能够鉴别或者比较
: monomer/tetramer？
: native page用了basic-native gel protocol。做western blot的话，使用的抗体和
: monomer或tetramer结合的效果会有差异吗？比如monomer的结合效果好，band清晰。抗
: 体和tetramer 反应弱，看不大出来band?
: 比较奇怪的是，6％的胶跑3个小时和6个小时的结果不一样。难道6个小时后所有的蛋白
: 跑出去了？不应该啊.
: 求高人指点。
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C*******e
发帖数: 4348 | 3 抗体结合不好说
因为抗体生成的时候用的是变性蛋白
识别的区域未必暴露在表面 |
T**********t
发帖数: 1604 | 4 Analytical Ultracentrifugation可以判断monomer/oligomer状态，但是需要的蛋白量
比较大。一个样品体积要大概400ul，absorbance最好在1左右，而且做完基本就废了，
拿不回来了。 |
m**z
发帖数: 787 | 5 that's not an easy experiment...
【在 T**********t 的大作中提到】
: Analytical Ultracentrifugation可以判断monomer/oligomer状态，但是需要的蛋白量
: 比较大。一个样品体积要大概400ul，absorbance最好在1左右，而且做完基本就废了，
: 拿不回来了。
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T**********t
发帖数: 1604 | 6 主要是仪器比较delicate吧，容易坏。所以帮我做AUC的那个实验室是有专人负责跑AUC
的，别人只管提供样品，不能插手仪器操作。就这样那仪器还三天两头坏掉。。。
【在 m**z 的大作中提到】
: that's not an easy experiment...
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m**z
发帖数: 787 | 7 对样品的要求也很高，比如纯度，稳定性什么的，因为一转就是十几个小时(velocity)
甚至两三天的（equilibrium).数据处理也不容易.不过对于oligomerization方面的问
题的确是best experiment to do, just not easy...
AUC
【在 T**********t 的大作中提到】
: 主要是仪器比较delicate吧，容易坏。所以帮我做AUC的那个实验室是有专人负责跑AUC
: 的，别人只管提供样品，不能插手仪器操作。就这样那仪器还三天两头坏掉。。。
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i********e
发帖数: 50 | 8
gel filtration出来的fraction还是需要别的方法来鉴定。原本是想native page的结
果比较可靠后用来检测gel filtration的fractions的。光从分光度来判断
gel filtration的fraction比较困难。1，蛋白质量少，很难有peak。2，单体蛋白就
550Kda,直接从bed volume就跑出来了。很怀疑跟4倍体能有retention time 上的显著
差异。
【在 a****k 的大作中提到】
: 可以run gel filtration column
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m**z
发帖数: 787 | 9 蛋白量倒是不用担心，这么大的蛋白用A220 backbone absorbance应该只要一点点蛋白
。不过对于一般的gel filtration column来讲，的确太大了
【在 i********e 的大作中提到】
:
: gel filtration出来的fraction还是需要别的方法来鉴定。原本是想native page的结
: 果比较可靠后用来检测gel filtration的fractions的。光从分光度来判断
: gel filtration的fraction比较困难。1，蛋白质量少，很难有peak。2，单体蛋白就
: 550Kda,直接从bed volume就跑出来了。很怀疑跟4倍体能有retention time 上的显著
: 差异。
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T**********t
发帖数: 1604 | 10 FPLC看A220 absorbance还要换lamp和filter吧？反正我的FPLC只能看254和280。为了
看这一个蛋白的aggregation买一套lamp+filter，还挺费钱的。。。
【在 m**z 的大作中提到】
: 蛋白量倒是不用担心，这么大的蛋白用A220 backbone absorbance应该只要一点点蛋白
: 。不过对于一般的gel filtration column来讲，的确太大了
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m**z
发帖数: 787 | 11 ok... 那么大的蛋白，里面trp/tyr应该不少把，也许A280也够了。或者bradford
assay on each fraction, could be done on a microtiter plate and a plate
reader。这个方法也是很灵敏的
【在 T**********t 的大作中提到】
: FPLC看A220 absorbance还要换lamp和filter吧？反正我的FPLC只能看254和280。为了
: 看这一个蛋白的aggregation买一套lamp+filter，还挺费钱的。。。
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a****k
发帖数: 1130 | 12 你不是有抗体的吗，gel filtration之后做western就好了啊。最近帮别人做了一些这
方面的实验，是可行的。550Kda在superose 6还有superdex 200上都是不会从void
position出来的，monomer和tetramer肯定是可以分开的
【在 i********e 的大作中提到】
:
: gel filtration出来的fraction还是需要别的方法来鉴定。原本是想native page的结
: 果比较可靠后用来检测gel filtration的fractions的。光从分光度来判断
: gel filtration的fraction比较困难。1，蛋白质量少，很难有peak。2，单体蛋白就
: 550Kda,直接从bed volume就跑出来了。很怀疑跟4倍体能有retention time 上的显著
: 差异。
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l**n
发帖数: 109 | 13 或者把蛋白构建成GFP fusion，用荧光检测。
【在 a****k 的大作中提到】
: 你不是有抗体的吗，gel filtration之后做western就好了啊。最近帮别人做了一些这
: 方面的实验，是可行的。550Kda在superose 6还有superdex 200上都是不会从void
: position出来的，monomer和tetramer肯定是可以分开的
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y****m
发帖数: 37 | 14
glycerol gradient, then western? blue native gel electrophorensis?
did you change to fresh buffer after a while? most likely the running buffer
went bad.
【在 i********e 的大作中提到】
: 有个超大蛋白，单体为550Kda, 细胞里是tetramer。想看一下转基因表达后的状态，是
: monomer/dimer/tetramer.请问除了native page还有什么方法能够鉴别或者比较
: monomer/tetramer？
: native page用了basic-native gel protocol。做western blot的话，使用的抗体和
: monomer或tetramer结合的效果会有差异吗？比如monomer的结合效果好，band清晰。抗
: 体和tetramer 反应弱，看不大出来band?
: 比较奇怪的是，6％的胶跑3个小时和6个小时的结果不一样。难道6个小时后所有的蛋白
: 跑出去了？不应该啊.
: 求高人指点。
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i********e
发帖数: 50 | 15
有抗体，western 没问题。问题是要鉴别是monomer还是tetramer.SDS-PAGE是变性蛋白
，出来的都是monomer了。实验目的是确定蛋白的状态，目前只想到native page 和gel
filtration.
谢谢你关于柱子的建议，打算试一下。可是出来的fraction还是需要别的方法来确定到
底是monomer或tetramer吧。就算出来2个peak,怎么能说是2种不同状态呢？
【在 a****k 的大作中提到】
: 你不是有抗体的吗，gel filtration之后做western就好了啊。最近帮别人做了一些这
: 方面的实验，是可行的。550Kda在superose 6还有superdex 200上都是不会从void
: position出来的，monomer和tetramer肯定是可以分开的
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i********e
发帖数: 50 | 16
谢谢。glycerol gradient要很多蛋白量才可以吧？blue native gel electropheresis
是什么？
buffer
这个的确不知道。非常感谢！不过很困惑，buffer为什么会went bad? PH的改变？
【在 y****m 的大作中提到】
:
: glycerol gradient, then western? blue native gel electrophorensis?
: did you change to fresh buffer after a while? most likely the running buffer
: went bad.
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i********e
发帖数: 50 | 17 请问上面的高人，dynamic light scattering 可行吗？以前做过一点，原理不懂。但
材料可以回收，就是用量比较大，而且要纯化蛋白。
请哪位能给科普一下？ |
m**z
发帖数: 787 | 18 yes. you need purified proteins for that. it basically gives you the info of
the size of the particle. you don't need a lot, maybe 10uM of several
hundred ul. I believe it can be recycled though.
【在 i********e 的大作中提到】
: 请问上面的高人，dynamic light scattering 可行吗？以前做过一点，原理不懂。但
: 材料可以回收，就是用量比较大，而且要纯化蛋白。
: 请哪位能给科普一下？
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i********e
发帖数: 50 | 19
of
非常感谢！请问DLS跟CD是一回事吗？我有未知的纯化样品和已知tetramer的纯化样品
，以前跟老板提过用DLS来做，结果被否决了。他说CD didn't work.我对光学原理真是
一窍不通。DLS是CD？
【在 m**z 的大作中提到】
: yes. you need purified proteins for that. it basically gives you the info of
: the size of the particle. you don't need a lot, maybe 10uM of several
: hundred ul. I believe it can be recycled though.
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m**z
发帖数: 787 | 20 totally different. CD stands for circular dichroism. It is used to monitor
the secondary structure of a protein. I suggest in your case, try gel
filtration chromatography first. Or native gel. These are probably the
easiest to do.
【在 i********e 的大作中提到】
:
: of
: 非常感谢！请问DLS跟CD是一回事吗？我有未知的纯化样品和已知tetramer的纯化样品
: ，以前跟老板提过用DLS来做，结果被否决了。他说CD didn't work.我对光学原理真是
: 一窍不通。DLS是CD？
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i********e
发帖数: 50 | 21 thank you very much!
看来还是得先解决native page。问题又转回来了。 |
m**z
发帖数: 787 | 22 Gel filtration also worth a try. It may be easier if you have the right
column and can separate the monomer/tetramer.
【在 i********e 的大作中提到】
: thank you very much!
: 看来还是得先解决native page。问题又转回来了。
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a****k
发帖数: 1130 | 23 就是说，你拿自己的sample run一个gel filtration column，collect每一个faction，然后用这些fraction做western blot （注：这时候SDS-PAGE会让蛋白变性根本就不重要，你只是要确定自己的蛋白是在哪些fraction里面）。gel filtration的每个fraction根据和standard蛋白位置的比较，是可以知道大概的size的，那不就知道你的protein的size了吗。你已知monomer是550Kda，到时候不就知道是monomer还是tetramer了吗
gel
【在 i********e 的大作中提到】
: thank you very much!
: 看来还是得先解决native page。问题又转回来了。
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i********e
发帖数: 50 | 24
faction，然后用这些fraction做western blot （注：这时候SDS-PAGE会让蛋白变性根
本就不重要，你只是要确定自己的蛋白是在哪些fraction里面）。gel filtration的每
个fraction根据和standard蛋白位置的比较，是可以知道大概的size的，那不就知道你
的protein的size了吗。你已知monomer是550Kda，到时候不就知道是monomer还是
tetramer了吗
我们的tetramer就是用gel filtration 分离纯化出来的，western 的结果也没问题。
现在怀疑monomer的存在。SDS-PAGE的话，假如原本是tetramer的蛋白也会变性成
monomer跑出来。这样就不知道原来fraction里的究竟是tetramer还是mononer.这就是
我为什么想用native-page的原因。monomer就有550Kda，一般gel filtration用的
standard 蛋白没有那么大的。最理想的结果是tetrmer在void volume,monomer不是。
用什么柱子能使2者的re
【在 a****k 的大作中提到】
: 就是说，你拿自己的sample run一个gel filtration column，collect每一个faction，然后用这些fraction做western blot （注：这时候SDS-PAGE会让蛋白变性根本就不重要，你只是要确定自己的蛋白是在哪些fraction里面）。gel filtration的每个fraction根据和standard蛋白位置的比较，是可以知道大概的size的，那不就知道你的protein的size了吗。你已知monomer是550Kda，到时候不就知道是monomer还是tetramer了吗
:
: gel
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a****k
发帖数: 1130 | 25 superose 6上面650KDa的standard蛋白和void还是有相当的距离的。不知道你当时用的
是什么gel filtration column？还有，load的sample volume，elute的speed也会有影响
【在 i********e 的大作中提到】
:
: faction，然后用这些fraction做western blot （注：这时候SDS-PAGE会让蛋白变性根
: 本就不重要，你只是要确定自己的蛋白是在哪些fraction里面）。gel filtration的每
: 个fraction根据和standard蛋白位置的比较，是可以知道大概的size的，那不就知道你
: 的protein的size了吗。你已知monomer是550Kda，到时候不就知道是monomer还是
: tetramer了吗
: 我们的tetramer就是用gel filtration 分离纯化出来的，western 的结果也没问题。
: 现在怀疑monomer的存在。SDS-PAGE的话，假如原本是tetramer的蛋白也会变性成
: monomer跑出来。这样就不知道原来fraction里的究竟是tetramer还是mononer.这就是
: 我为什么想用native-page的原因。monomer就有550Kda，一般gel filtration用的
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n********k
发帖数: 2818 | 26 maybe I shall go to ask you to do me a favor on my problem a couple of
months later...
影响
【在 a****k 的大作中提到】
: superose 6上面650KDa的standard蛋白和void还是有相当的距离的。不知道你当时用的
: 是什么gel filtration column？还有，load的sample volume，elute的speed也会有影响
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a****k
发帖数: 1130 | 27 a couple of months later...嗯，随时欢迎，希望帮得上忙
【在 n********k 的大作中提到】
: maybe I shall go to ask you to do me a favor on my problem a couple of
: months later...
:
: 影响
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