e********r
发帖数: 147 | 1 最近我们体外实验发现一个蛋白同时存在monomer和trimer形式，有意思的是，monomer
状态下，能够结合另一个蛋白，激活下游基因的表达。
现在想在体内in vivo检查一下不同刺激条件下，monomer和trimer之间比率的变化。以
前没做过类似的工作，请问应该肿么搞？刺激前后把蛋白交联起来，然后跑SDS-PAGE,
Western blotting这样的方法可行不？非常感谢。 |
C*********h
发帖数: 83 | 2 两篇文章采用了不同的方法。供参考。
以前有人贴过。
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NIH 刘正刚实验室 在2014年一月的NCB文章中，刘正刚也show MLKL可以形成三聚体同
时跑到细胞膜上，并激活下游的钙离子通道，来导致细胞坏死。
Nat Cell Biol. 2014 Jan;16(1):55-65. doi: 10.1038/ncb2883. Epub 2013 Dec 8.
Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF
-induced necroptosis.
厦门大学 韩家淮实验室几乎在同一时间，在Cell Research上发表了另外一篇paper。
Cell Research (2014) 24:105–121. doi:10.1038/cr.2013.171; published online
24 December 2013
Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane
leads to necrotic cell death
他们也得出类似的结论，不同的是，他们认为MLKL可以形成三聚体同时跑到细胞膜上，
并激活下游的钠离子通道，来导致细胞坏死。
原文链接：
http://www.casgene.com.cn/news/?34_29.html
monomer
,
【在 e********r 的大作中提到】
: 最近我们体外实验发现一个蛋白同时存在monomer和trimer形式，有意思的是，monomer
: 状态下，能够结合另一个蛋白，激活下游基因的表达。
: 现在想在体内in vivo检查一下不同刺激条件下，monomer和trimer之间比率的变化。以
: 前没做过类似的工作，请问应该肿么搞？刺激前后把蛋白交联起来，然后跑SDS-PAGE,
: Western blotting这样的方法可行不？非常感谢。
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s******9
发帖数: 283 | 3 方法很多，检测方法可以是原位或非原位。蛋白交联一般应用在非原位的检测，通常与
质谱技术结合来定量。跑胶后Western检测也可能行，不过非特异性的交联会让定量分
析很困难。原位方法可以用FRET技术，适合于低通量定量分析。未来高通量原位蛋白相
互作用分析可以用barcoding抗体和原位测序技术。
这篇2005年综述对传统的技术归纳的不错：
New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15718127 |
e****s
发帖数: 1125 | 4 在in vivo的话，FRET,BRET, Split GFP等等。那些都相对蛮复杂的。
相对简单的办法就是Co-IP。在你蛋白上放上不同的tag，比较刺激前后的
oligomerization水平的变化。 |
e********r
发帖数: 147 | 5 哇，大家回复得好快！谢谢，信息量很大，我要学习...... |
