C*******e
发帖数: 4348 | 1 乘着这会儿人气高，求教一个PCR中遇到的问题哈，说实在的这是第一次遇到这么诡异的PCR问题，
这么多年下来大大小小各式各样的PCR都做过，扩增大于10kb都没有遇到过不知道如何trouble
shooting的时候。
最近从某个E.coli plasmid里PCR一个非E.coli的origin X(这个plasmid既有Ecoli的
origin又有另外某个细菌X的origin X，既可以在E.coli里维持也可以在细菌X里维持)。这个
origin X有3.6kb长，照理说用plasmid做模板，3.6kb也不算多长，应该不会太麻烦；可是做下
来跑胶就是干干净净，没有条带，没有primer dimer，没有非特异产物，什么都没有（当然如果模
板plasmid加多一点，能看到模板）；annealing温度梯度，还有别的optimize都做了，还是一
样；还有过用linear plasmid做模板，还是一样。
另外还设计了这个3.6kb区域的5个sequencing primer，因为一直P不出来，就有点怀疑这个
E.coli plasmid，因为是别的实验室给我们的，送去测序以后没有 |
n********k
发帖数: 2818 | 2 didn't quite get it...but my bet would be wrong plasmids...it would be too
odd if it is not...the thing in well shall be runon PCR products or
something genome or together with proteins stuff. or somtimes dirty wells...
virtually everytime I run into problem with plasmid PCR, the problems were
with plasmids...u can spat to plasmid PCR, it shall still work:)))
菌的
【在 C*******e 的大作中提到】
: 乘着这会儿人气高，求教一个PCR中遇到的问题哈，说实在的这是第一次遇到这么诡异的PCR问题，
: 这么多年下来大大小小各式各样的PCR都做过，扩增大于10kb都没有遇到过不知道如何trouble
: shooting的时候。
: 最近从某个E.coli plasmid里PCR一个非E.coli的origin X(这个plasmid既有Ecoli的
: origin又有另外某个细菌X的origin X，既可以在E.coli里维持也可以在细菌X里维持)。这个
: origin X有3.6kb长，照理说用plasmid做模板，3.6kb也不算多长，应该不会太麻烦；可是做下
: 来跑胶就是干干净净，没有条带，没有primer dimer，没有非特异产物，什么都没有（当然如果模
: 板plasmid加多一点，能看到模板）；annealing温度梯度，还有别的optimize都做了，还是一
: 样；还有过用linear plasmid做模板，还是一样。
: 另外还设计了这个3.6kb区域的5个sequencing primer，因为一直P不出来，就有点怀疑这个
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C*******e
发帖数: 4348 | 3 可能我没写清楚
唉，现在中文表达能力越来越差了
我也怕是wrong plasmid
所以今天从细菌X里提了native plasmid，肯定是有我要的origin的
PCR还是出不来
另外加样孔里是什么我不好说
因为作为template的plasmid单独跑并没有留在孔里
从同样的PCR master mix里加别的primers,template做PCR是正常的，跑胶以后加样孔
也是干
净的
too
wells...
were
【在 n********k 的大作中提到】
: didn't quite get it...but my bet would be wrong plasmids...it would be too
: odd if it is not...the thing in well shall be runon PCR products or
: something genome or together with proteins stuff. or somtimes dirty wells...
: virtually everytime I run into problem with plasmid PCR, the problems were
: with plasmids...u can spat to plasmid PCR, it shall still work:)))
:
: 菌的
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C*******e
发帖数: 4348 | |
a****o
发帖数: 1786 | 5 My recommendation is to sequence the plasmid before doing more experiments. |
C*******e
发帖数: 4348 | 6 what about the native plasmid directly isolated from bacteria X ?
It contain the origin I need for sure. But I still can't PCR it out.
experiments.
【在 a****o 的大作中提到】
: My recommendation is to sequence the plasmid before doing more experiments.
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d**********t
发帖数: 20415 | 7 把整个质粒测一边序，从别人那里要过来的质粒出什么问题都有可能
另外看看引物有没有问题，别犯什么低级错误，比如用的引物一个方向什么...能找个
其他质粒作positive control的话最好
异的PCR问题，
何trouble
)。这个
；可是做下
（当然如果模
，还是一
疑这个
【在 C*******e 的大作中提到】
: 乘着这会儿人气高，求教一个PCR中遇到的问题哈，说实在的这是第一次遇到这么诡异的PCR问题，
: 这么多年下来大大小小各式各样的PCR都做过，扩增大于10kb都没有遇到过不知道如何trouble
: shooting的时候。
: 最近从某个E.coli plasmid里PCR一个非E.coli的origin X(这个plasmid既有Ecoli的
: origin又有另外某个细菌X的origin X，既可以在E.coli里维持也可以在细菌X里维持)。这个
: origin X有3.6kb长，照理说用plasmid做模板，3.6kb也不算多长，应该不会太麻烦；可是做下
: 来跑胶就是干干净净，没有条带，没有primer dimer，没有非特异产物，什么都没有（当然如果模
: 板plasmid加多一点，能看到模板）；annealing温度梯度，还有别的optimize都做了，还是一
: 样；还有过用linear plasmid做模板，还是一样。
: 另外还设计了这个3.6kb区域的5个sequencing primer，因为一直P不出来，就有点怀疑这个
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C*******e
发帖数: 4348 | 8 引物已经检查过很多遍了，没有问题
整个质粒测个序需要不少时间和精力
取决于我老板觉得值不值得做
我现在的问题是需要这个PCR
用了native plasmid（endogenous plasmid)也没有批出来
假设plasmid没有问题，遇到同样的PCR问题该怎么trouble shooting呢
【在 d**********t 的大作中提到】
: 把整个质粒测一边序，从别人那里要过来的质粒出什么问题都有可能
: 另外看看引物有没有问题，别犯什么低级错误，比如用的引物一个方向什么...能找个
: 其他质粒作positive control的话最好
:
: 异的PCR问题，
: 何trouble
: )。这个
: ；可是做下
: （当然如果模
: ，还是一
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d**********t
发帖数: 20415 | 9 你一开始就说那个区段测不出，很可能那个区段就有问题，测序应该是最好的办法了
其它么，那别的质粒和引物做个positive control确定PCR的reagent没有问题
取菌X做个菌落PCR，看看能不能P出来，有些大的plasmid你提取的方法不好容易断
我能想到的也就这么多了...
【在 C*******e 的大作中提到】
: 引物已经检查过很多遍了，没有问题
: 整个质粒测个序需要不少时间和精力
: 取决于我老板觉得值不值得做
: 我现在的问题是需要这个PCR
: 用了native plasmid（endogenous plasmid)也没有批出来
: 假设plasmid没有问题，遇到同样的PCR问题该怎么trouble shooting呢
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C*******e
发帖数: 4348 | 10 谢谢建议。很多你提到的我都做了，PCR reagent肯定没问题，因为同样的master mix
，加不同的
primer\template是可以P出产物的。另外这个endogenous plasmid不大，8kb不到，我
提了以后
跑过胶确认过。
有时候真的很不喜欢那些从别人实验室要来的材料啊。
【在 d**********t 的大作中提到】
: 你一开始就说那个区段测不出，很可能那个区段就有问题，测序应该是最好的办法了
: 其它么，那别的质粒和引物做个positive control确定PCR的reagent没有问题
: 取菌X做个菌落PCR，看看能不能P出来，有些大的plasmid你提取的方法不好容易断
: 我能想到的也就这么多了...
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R*****w
发帖数: 447 | 11 最大的可能性是质粒有问题。
不愿测序你可以酶切鉴定一下这个质粒是否有问题啊,
还有，你如果用提取的质粒做模板一定要稀释 >10^3
"不过这次留了个神，跑胶以后加样孔里有很多东西没跑进胶里去的样子"好像你提的质
粒都有问题。如果这些东西有你要的质粒，那你更应该稀释 |
C*******e
发帖数: 4348 | 12 酶切鉴定过了
E.coli来源的那一半和预期相符
Origin X的那一半就不相符
所以觉得质粒实际的序列和我们手上的序列不一样
另外我还有不加DNA polymerase的control
跑胶看是干干净净的，加样孔里什么都没有
【在 R*****w 的大作中提到】
: 最大的可能性是质粒有问题。
: 不愿测序你可以酶切鉴定一下这个质粒是否有问题啊,
: 还有，你如果用提取的质粒做模板一定要稀释 >10^3
: "不过这次留了个神，跑胶以后加样孔里有很多东西没跑进胶里去的样子"好像你提的质
: 粒都有问题。如果这些东西有你要的质粒，那你更应该稀释
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b******n
发帖数: 4225 | 13 没什么大不了的啊，直接送质粒去让测序公司给你测通
4K也就几个反应而已
加上引物估计100美金左右搞定吧，就是要等时间长点
你老板一天pay给你的收入都不止100美金了吧
【在 C*******e 的大作中提到】
: 酶切鉴定过了
: E.coli来源的那一半和预期相符
: Origin X的那一半就不相符
: 所以觉得质粒实际的序列和我们手上的序列不一样
: 另外我还有不加DNA polymerase的control
: 跑胶看是干干净净的，加样孔里什么都没有
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C*******e
发帖数: 4348 | 14 我的目的不在于搞清楚这个质粒是什么
是在于怎么扩增出我要的origin X
另外这个质粒比较大，>8k
等不了测序那么久，项目要往下进行啊
【在 b******n 的大作中提到】
: 没什么大不了的啊，直接送质粒去让测序公司给你测通
: 4K也就几个反应而已
: 加上引物估计100美金左右搞定吧，就是要等时间长点
: 你老板一天pay给你的收入都不止100美金了吧
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b******n
发帖数: 4225 | 15 不需要你搞清楚整个质粒啊，你说E.coli的origin能P出来，那就不用测序了
细菌X的origin你P不出来，大小是4k左右
那就从这个origin最外端开始测序
你只要设计好起始引物就可以了，其余都丢给公司或测序中心做
你算每次测序800bp，6个反应6次搞定
想快一点从origin的两端测，6个反应3次搞定
大概10天吧
10天随便做点别的什么就过去了
实在不行读文献也可以啊
【在 C*******e 的大作中提到】
: 我的目的不在于搞清楚这个质粒是什么
: 是在于怎么扩增出我要的origin X
: 另外这个质粒比较大，>8k
: 等不了测序那么久，项目要往下进行啊
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C*******e
发帖数: 4348 | 16 ....不是纠结这个测不测序的问题
不知道是不是我原帖没有写清楚
我还提了细菌X的endogenous plasmid，有这个origin的
提的质粒跑胶确认过
还是一样P不出来
或者说P完了以后只有加样孔里有东西
不加酶的control跑胶加样孔里干净的
同样的master mix PCR别的东西（primer template不一样）则跑胶正常，加样孔没东
西，扩
增条带在它该在的地方
有没有遇到过这种情况的？
【在 b******n 的大作中提到】
: 不需要你搞清楚整个质粒啊，你说E.coli的origin能P出来，那就不用测序了
: 细菌X的origin你P不出来，大小是4k左右
: 那就从这个origin最外端开始测序
: 你只要设计好起始引物就可以了，其余都丢给公司或测序中心做
: 你算每次测序800bp，6个反应6次搞定
: 想快一点从origin的两端测，6个反应3次搞定
: 大概10天吧
: 10天随便做点别的什么就过去了
: 实在不行读文献也可以啊
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b******n
发帖数: 4225 | 17 可能咱们追求的目标不太相同
我想如果是那个shuttle vector能正常work的话（也就是两个细菌都能正常复制）
说明上面两个origin都能work的话
那么你弄清楚这个细菌x来源的origin是什么你才知道你设计的引物是不是对的
我知道你是根据文献报道设计的
现在是你的PCR不能扩增出来那么很可能是引物和模板不配对
引物你确定没问题，那么可能是模板出了问题
所以我让你去测序那个origin啊
加样孔不干净你把模板DNA酚氯仿抽提酒精沉淀一下可以了
不是大问题
我不认为PCR没结果不是因为PCR本身，
因为 1) PCR太常规了，出错机会很小，而且容易设立对照排除
2) 你设计的引物直接测序测不出，无论是E.coli来源的质粒还是细菌x来源的质粒
我个人觉得现在问题指向的是模板
【在 C*******e 的大作中提到】
: ....不是纠结这个测不测序的问题
: 不知道是不是我原帖没有写清楚
: 我还提了细菌X的endogenous plasmid，有这个origin的
: 提的质粒跑胶确认过
: 还是一样P不出来
: 或者说P完了以后只有加样孔里有东西
: 不加酶的control跑胶加样孔里干净的
: 同样的master mix PCR别的东西（primer template不一样）则跑胶正常，加样孔没东
: 西，扩
: 增条带在它该在的地方
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d**********t
发帖数: 20415 | 18 加样孔的问题不是模板ＤＮＡ的问题吧
他说不加酶的ｍｉｘ孔里就没有
难道说他Ｐ出来了很大很长的ＤＮＡ，跑不出孔了都，或者说ＤＮＡ和酶结合了
ＰＣＲ完了以后直接用回收试剂盒或者乙醇沉淀回收了再跑跑看
【在 b******n 的大作中提到】
: 可能咱们追求的目标不太相同
: 我想如果是那个shuttle vector能正常work的话（也就是两个细菌都能正常复制）
: 说明上面两个origin都能work的话
: 那么你弄清楚这个细菌x来源的origin是什么你才知道你设计的引物是不是对的
: 我知道你是根据文献报道设计的
: 现在是你的PCR不能扩增出来那么很可能是引物和模板不配对
: 引物你确定没问题，那么可能是模板出了问题
: 所以我让你去测序那个origin啊
: 加样孔不干净你把模板DNA酚氯仿抽提酒精沉淀一下可以了
: 不是大问题
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C*******e
发帖数: 4348 | 19 我没有说细菌X来源的endogenous plasmid直接测序测不出
我说E.coli的那个测不出
细菌来源的我前天才提的，不多，做PCR可以，测序不够，所以还没有测序
我同意你的说法E.coli的那个plasmid多半有些什么问题
但是我用细菌X的endogenous plasmid做PCR出来的结果是一样的
【在 b******n 的大作中提到】
: 可能咱们追求的目标不太相同
: 我想如果是那个shuttle vector能正常work的话（也就是两个细菌都能正常复制）
: 说明上面两个origin都能work的话
: 那么你弄清楚这个细菌x来源的origin是什么你才知道你设计的引物是不是对的
: 我知道你是根据文献报道设计的
: 现在是你的PCR不能扩增出来那么很可能是引物和模板不配对
: 引物你确定没问题，那么可能是模板出了问题
: 所以我让你去测序那个origin啊
: 加样孔不干净你把模板DNA酚氯仿抽提酒精沉淀一下可以了
: 不是大问题
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s******y
发帖数: 28562 | 20 从别人那里要来的质粒序列常常是不可信的。
因为不是每个实验室都很仔细检查他们的序列的。我有一次用了一个大牛实验室
给我的特殊质粒来表达蛋白，表达没有问题，但是后来我想往质粒序列里面塞
一些自己设计的东西，但是发现酶切出来的片断和图里标示的根本就是两码事。
后来索性测了一下序列，发现质粒的真实序列和他们网上写的序列差的不是一点
两点。
我建议你用E.coli来源的那部分的序列设计一个primer 往x 细菌
的序列里面测。看看连进去的到底是什么序列。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 酶切鉴定过了
: E.coli来源的那一半和预期相符
: Origin X的那一半就不相符
: 所以觉得质粒实际的序列和我们手上的序列不一样
: 另外我还有不加DNA polymerase的control
: 跑胶看是干干净净的，加样孔里什么都没有
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h******g
发帖数: 1521 | 21 如果知道理论序列，看看sequence的特性，GC, 结构什么的，有的基因pcr很难批的，
有的时候需要一些特殊的pcr kit才行。 |
H***o
发帖数: 533 | 22 1. Check for sequence. Look for RE sites in your primer sequences and run
gel to see pattern, if not cut or less fragments, your current sequence (or
at least at the primer sites) is wrong. If so, no matter how hard you try
PCR, it won't work; -You indicate the RE pattern seems not right, don't bang
your head againt wall about PCR if the primer sequence is not right
2. Double check primers--check your order receipt, are the sequences right?
Are the primers going inward from opposite directions;
【在 C*******e 的大作中提到】
: 乘着这会儿人气高，求教一个PCR中遇到的问题哈，说实在的这是第一次遇到这么诡异的PCR问题，
: 这么多年下来大大小小各式各样的PCR都做过，扩增大于10kb都没有遇到过不知道如何trouble
: shooting的时候。
: 最近从某个E.coli plasmid里PCR一个非E.coli的origin X(这个plasmid既有Ecoli的
: origin又有另外某个细菌X的origin X，既可以在E.coli里维持也可以在细菌X里维持)。这个
: origin X有3.6kb长，照理说用plasmid做模板，3.6kb也不算多长，应该不会太麻烦；可是做下
: 来跑胶就是干干净净，没有条带，没有primer dimer，没有非特异产物，什么都没有（当然如果模
: 板plasmid加多一点，能看到模板）；annealing温度梯度，还有别的optimize都做了，还是一
: 样；还有过用linear plasmid做模板，还是一样。
: 另外还设计了这个3.6kb区域的5个sequencing primer，因为一直P不出来，就有点怀疑这个
|
C*******e
发帖数: 4348 | 23 谢谢这么详尽的trouble shooting
1. 限制性内切酶切E.coli plasmid显示，根据我们手上有的序列信息，如果只切E.
coli源的那
一半，酶切图谱就是正确的；如果在细菌X的origin那一段序列也切，酶切图谱就不能
完全吻合。所
以现在已经放弃用那个E.coli plasmid。
2.这个E.coli plasmid，同一管样品，别的人做PCR，还有ligation，酶切等等（都在E
.coli
源的那一半）是完全没有问题的，所以排除E.coli plasmid不够纯的问题。
3.同样的PCR master mix，用不同模板、引物，是可以PCR没有问题的，所以和试剂没
有关系。
4.引物序列等等已经确认过很多次；不过我没有确认到底有多少DNA在里面，谢谢提醒
，回头会查查
看。
5.要扩增的序列GC%是60%，不算特别高。PCR enhancer等等也试过，没有帮助。
6.我还提到如果不加DNA聚合酶的话加样孔里就没有东西；后来试过酚氯仿提取、乙醇
沉淀，再跑胶
只有一点smear，所以现在确定那是蛋白+核酸在孔里；为什么同样的master mix做别的
P
【在 H***o 的大作中提到】
: 1. Check for sequence. Look for RE sites in your primer sequences and run
: gel to see pattern, if not cut or less fragments, your current sequence (or
: at least at the primer sites) is wrong. If so, no matter how hard you try
: PCR, it won't work; -You indicate the RE pattern seems not right, don't bang
: your head againt wall about PCR if the primer sequence is not right
: 2. Double check primers--check your order receipt, are the sequences right?
: Are the primers going inward from opposite directions;
|
T**********t
发帖数: 1604 | 24 测序是王道。
哪怕你等不及测完整个plasmid，先测这个origin X两头的各500个bp左右，一天就搞定
了。拿这两个序列再设计一对引物，总能P出点东西来吧。 |
