X***n
发帖数: 366 | 1 5.5, 6.5, 7.5 kb三个片段， PCR 能出来。链接到4.7 kb的pHcRed1-C1 载体里，出来
的都是空的。pHcRed1-C1是高拷贝质粒，是不是因为太大了不能有效复制？ |
b******n
发帖数: 4225 | 2 7.5 kb能P出来还是比较牛的
用的啥酶啊？
【在 X***n 的大作中提到】
: 5.5, 6.5, 7.5 kb三个片段， PCR 能出来。链接到4.7 kb的pHcRed1-C1 载体里，出来
: 的都是空的。pHcRed1-C1是高拷贝质粒，是不是因为太大了不能有效复制？
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a***a
发帖数: 40617 | 3 啥酶都能P那么长，关键是看突变率
【在 b******n 的大作中提到】
: 7.5 kb能P出来还是比较牛的
: 用的啥酶啊？
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X***n
发帖数: 366 | 4 Invitrogen Plantinium Taq
【在 b******n 的大作中提到】
: 7.5 kb能P出来还是比较牛的
: 用的啥酶啊？
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X***n
发帖数: 366 | 5 一般的Taq也可以这么长吗？
【在 a***a 的大作中提到】
: 啥酶都能P那么长，关键是看突变率
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a***a
发帖数: 40617 | 6 我们自己表达纯化的taq都P过11kb
【在 X***n 的大作中提到】
: 一般的Taq也可以这么长吗？
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s*******y
发帖数: 2366 | 7 不了解这个载体，有没有查文献看别人插入最大多大？
可以试着用promega的TSAP (Thermosensitive Alkaline Phosphatase)处理一下单酶切
纯化载体，使其无法self ligate
【在 X***n 的大作中提到】
: 5.5, 6.5, 7.5 kb三个片段， PCR 能出来。链接到4.7 kb的pHcRed1-C1 载体里，出来
: 的都是空的。pHcRed1-C1是高拷贝质粒，是不是因为太大了不能有效复制？
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s*******y
发帖数: 2366 | 8 关键是突变吧
【在 X***n 的大作中提到】
: 一般的Taq也可以这么长吗？
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s*******y
发帖数: 2366 | 9 崇拜一下
【在 a***a 的大作中提到】
: 我们自己表达纯化的taq都P过11kb
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X***n
发帖数: 366 | 10 牛！
敢问牛人把7.5 kb的insert连到4.7 kb的500 copies per cell的质粒中是否可能？用
DH 10B chemocompetent cell行不？
【在 a***a 的大作中提到】
: 我们自己表达纯化的taq都P过11kb
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a***a
发帖数: 40617 | 11 你问问题没问对啊
现在你是连接有问题
你是双酶切？酶切是否彻底？是否自连？这些都是问题
你要保证双酶切彻底的情况下用CIP treat以后再用合适的比例进行足够时间的
ligation
克隆问题是板上最常见的问题。我也觉得是最没有必要问的问题
与其这里问，不如问自己lab的师兄、师姐或者postdoc，效果会更好
因为要让别人给你troubleshoot，你至少得写几页的details
【在 X***n 的大作中提到】
: 牛！
: 敢问牛人把7.5 kb的insert连到4.7 kb的500 copies per cell的质粒中是否可能？用
: DH 10B chemocompetent cell行不？
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X***n
发帖数: 366 | 12 文献中都不大，不超过5k。
想想BAC是上百k的都行，我为什么就是作不出来呢！急死了。
【在 s*******y 的大作中提到】
: 不了解这个载体，有没有查文献看别人插入最大多大？
: 可以试着用promega的TSAP (Thermosensitive Alkaline Phosphatase)处理一下单酶切
: 纯化载体，使其无法self ligate
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a***a
发帖数: 40617 | 13 跟你insert多长P关系也没有。。。
唯一的关系就是以后算ligation 摩尔比的时候可以考虑一下
【在 X***n 的大作中提到】
: 文献中都不大，不超过5k。
: 想想BAC是上百k的都行，我为什么就是作不出来呢！急死了。
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s*******y
发帖数: 2366 | 14 我也觉得没关系
insert大小对ligation影响不大
摩尔比关系也不大。。。
我觉得应该是酶切不彻底
跟你insert多长P关系也没有。。。
唯一的关系就是以后算ligation 摩尔比的时候可以考虑一下
【在 a***a 的大作中提到】
: 跟你insert多长P关系也没有。。。
: 唯一的关系就是以后算ligation 摩尔比的时候可以考虑一下
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a***a
发帖数: 40617 | 15 做过300个constructs的飘过
【在 s*******y 的大作中提到】
: 我也觉得没关系
: insert大小对ligation影响不大
: 摩尔比关系也不大。。。
: 我觉得应该是酶切不彻底
:
: 跟你insert多长P关系也没有。。。
: 唯一的关系就是以后算ligation 摩尔比的时候可以考虑一下
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s*******y
发帖数: 2366 | 16 敬仰之情滔滔江水~~~~~~
小菜鸟飘过
做过300个constructs的飘过
【在 a***a 的大作中提到】
: 做过300个constructs的飘过
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p*****m
发帖数: 7030 | 17 你们lab做的这是什么project啊 俺本来觉得只有结构lab才有这种可能。。
【在 a***a 的大作中提到】
: 做过300个constructs的飘过
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X***n
发帖数: 366 | 18 惭愧。我是postdoc，实验室里就我一个人做分生。
双酶切， SacI和SalI，没有CIP处理。
这种情况下3：1链接过夜没问题吧？
只是想问问版上是否自己的设计本身就不合理。
主要是另外7个小的都出来了，这三个耽搁太久了。有些急。
【在 a***a 的大作中提到】
: 你问问题没问对啊
: 现在你是连接有问题
: 你是双酶切？酶切是否彻底？是否自连？这些都是问题
: 你要保证双酶切彻底的情况下用CIP treat以后再用合适的比例进行足够时间的
: ligation
: 克隆问题是板上最常见的问题。我也觉得是最没有必要问的问题
: 与其这里问，不如问自己lab的师兄、师姐或者postdoc，效果会更好
: 因为要让别人给你troubleshoot，你至少得写几页的details
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a***a
发帖数: 40617 | 19 你说对了
【在 p*****m 的大作中提到】
: 你们lab做的这是什么project啊 俺本来觉得只有结构lab才有这种可能。。
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p*****m
发帖数: 7030 | 20 啊哦 我印象里你不是做结构的 那这就不奇怪了 我家LD本科时候就有3个月100个const
ruct的壮举。。
【在 a***a 的大作中提到】
: 你说对了
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s*******y
发帖数: 2366 | 21 那就一个一个切
看看链的起来不
你ligate的时候没做self ligate的control吗？
惭愧。我是postdoc，实验室里就我一个人做分生。
双酶切， SacI和SalI，没有CIP处理。
这种情况下3：1链接过夜没问题吧？
只是想问问版上是否自己的设计本身就不合理。
主要是另外7个小的都出来了，这三个耽搁太久了。有些急。
【在 X***n 的大作中提到】
: 惭愧。我是postdoc，实验室里就我一个人做分生。
: 双酶切， SacI和SalI，没有CIP处理。
: 这种情况下3：1链接过夜没问题吧？
: 只是想问问版上是否自己的设计本身就不合理。
: 主要是另外7个小的都出来了，这三个耽搁太久了。有些急。
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s*******y
发帖数: 2366 | 22 两个都是生物啊，幸福
const
【在 p*****m 的大作中提到】
: 啊哦 我印象里你不是做结构的 那这就不奇怪了 我家LD本科时候就有3个月100个const
: ruct的壮举。。
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a***a
发帖数: 40617 | 23 如楼上所说，比例不是最关键的。关键还是末端是否真的没问题
另外有些constructs成功率本来就是很低
建议你CIP处理一下，然后连接过夜，转化以后全部涂板
【在 X***n 的大作中提到】
: 惭愧。我是postdoc，实验室里就我一个人做分生。
: 双酶切， SacI和SalI，没有CIP处理。
: 这种情况下3：1链接过夜没问题吧？
: 只是想问问版上是否自己的设计本身就不合理。
: 主要是另外7个小的都出来了，这三个耽搁太久了。有些急。
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p*****m
发帖数: 7030 | 24 这个很普遍把 呵呵
【在 s*******y 的大作中提到】
: 两个都是生物啊，幸福
:
: const
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a***a
发帖数: 40617 | 25 我是一周12个，从PCR做到small scale protein expression
纯做construct，一周做过30多个
不过比这个有点儿傻
都是没技术含量的活儿
const
【在 p*****m 的大作中提到】
: 啊哦 我印象里你不是做结构的 那这就不奇怪了 我家LD本科时候就有3个月100个const
: ruct的壮举。。
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a***a
发帖数: 40617 | 26 我怎么觉得是悲剧
【在 s*******y 的大作中提到】
: 两个都是生物啊，幸福
:
: const
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p*****m
发帖数: 7030 | 27 没比啊 不说到这儿了么。。
【在 a***a 的大作中提到】
: 我是一周12个，从PCR做到small scale protein expression
: 纯做construct，一周做过30多个
: 不过比这个有点儿傻
: 都是没技术含量的活儿
:
: const
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s*******y
发帖数: 2366 | 28 身边不多，偶ld也不是做这个的，帮不上我，呜呜
【在 p*****m 的大作中提到】
: 这个很普遍把 呵呵
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p*****m
发帖数: 7030 | 29 at least we can appreciate each other's everyday life..
【在 a***a 的大作中提到】
: 我怎么觉得是悲剧
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s*******y
发帖数: 2366 | 30 曾经一个就做的很痛苦:(
我是一周12个，从PCR做到small scale protein expression
纯做construct，一周做过30多个
不过比这个有点儿傻
都是没技术含量的活儿
const
【在 a***a 的大作中提到】
: 我是一周12个，从PCR做到small scale protein expression
: 纯做construct，一周做过30多个
: 不过比这个有点儿傻
: 都是没技术含量的活儿
:
: const
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s*******y
发帖数: 2366 | 31 长远看来，嗯...
但是读书的时候 很幸福~
【在 a***a 的大作中提到】
: 我怎么觉得是悲剧
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a***a
发帖数: 40617 | 32 我是心里有感触
就是因为老中太能干了，老板才把我们当cheap labor用到死
后来老美都是直接送公司
所有序列都是合成的，连载体，转化全部自动化
最后还是high thru put跑个大SDS PAGE precast gel
人基本不干啥事，就几十个几十个筛了
所以说，千万别显得自己能干
【在 p*****m 的大作中提到】
: 没比啊 不说到这儿了么。。
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X***n
发帖数: 366 | 33 多谢！
【在 a***a 的大作中提到】
: 如楼上所说，比例不是最关键的。关键还是末端是否真的没问题
: 另外有些constructs成功率本来就是很低
: 建议你CIP处理一下，然后连接过夜，转化以后全部涂板
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a***a
发帖数: 40617 | 34 “appreciate”？
you gotta be kidding me
【在 p*****m 的大作中提到】
: at least we can appreciate each other's everyday life..
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a***a
发帖数: 40617 | 35 最可怕的还是一个lab的，如果还同居，一天岂不是24hr面对面。。。恐怖
【在 s*******y 的大作中提到】
: 长远看来，嗯...
: 但是读书的时候 很幸福~
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a***a
发帖数: 40617 | 36 的确碰到过一些土鳖constructs，涂整整1ml的转化，最后就2，3个colonies
对了，不要涂太浓，也会有问题
【在 X***n 的大作中提到】
: 多谢！
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p*****m
发帖数: 7030 | 37 真的啊 我现在做的事情 换个LD会b4致死的
【在 a***a 的大作中提到】
: “appreciate”？
: you gotta be kidding me
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a***a
发帖数: 40617 | 38 我现在做的事情，都不敢找LD
【在 p*****m 的大作中提到】
: 真的啊 我现在做的事情 换个LD会b4致死的
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p*****m
发帖数: 7030 | 39 ......
【在 a***a 的大作中提到】
: 我现在做的事情，都不敢找LD
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a***a
发帖数: 40617 | 40 每次给别人说我学生物的，都小脸一红，低下头去搓衣角
【在 p*****m 的大作中提到】
: ......
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s*******y
发帖数: 2366 | 41 24h 腻在一起我不怕~
就是ld不能帮忙做实验和troubleshoot...
【在 a***a 的大作中提到】
: 最可怕的还是一个lab的，如果还同居，一天岂不是24hr面对面。。。恐怖
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p*****m
发帖数: 7030 | 42 这说的也是 不过老美这么懒的混到最后thesis defense连个晶体也没有的也多的是 老
中这样的估计不会有。。单说结构
【在 a***a 的大作中提到】
: 我是心里有感触
: 就是因为老中太能干了，老板才把我们当cheap labor用到死
: 后来老美都是直接送公司
: 所有序列都是合成的，连载体，转化全部自动化
: 最后还是high thru put跑个大SDS PAGE precast gel
: 人基本不干啥事，就几十个几十个筛了
: 所以说，千万别显得自己能干
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a***a
发帖数: 40617 | 43 你还年轻，过5年以后你就明白了
【在 s*******y 的大作中提到】
: 24h 腻在一起我不怕~
: 就是ld不能帮忙做实验和troubleshoot...
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s*******y
发帖数: 2366 | 44 嗯，我能理解！
【在 a***a 的大作中提到】
: 你还年轻，过5年以后你就明白了
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p*****m
发帖数: 7030 | 45 不用把 我还是很骄傲说我是biologist的 有时候熟了的话也许会自嘲下 不过骨子里我
还是很骄傲的。。
【在 a***a 的大作中提到】
: 每次给别人说我学生物的，都小脸一红，低下头去搓衣角
|
a***a
发帖数: 40617 | 46 我就准备着裸体defense了，如果老板让的话。。。
关键还是看命，有人的晶体眼皮底下眼看着就长出来了。。。
【在 p*****m 的大作中提到】
: 这说的也是 不过老美这么懒的混到最后thesis defense连个晶体也没有的也多的是 老
: 中这样的估计不会有。。单说结构
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a***a
发帖数: 40617 | 47 我4年前也很骄傲，还常常引用丘吉尔表扬伦敦空战飞行员的那番话激励自己
【在 p*****m 的大作中提到】
: 不用把 我还是很骄傲说我是biologist的 有时候熟了的话也许会自嘲下 不过骨子里我
: 还是很骄傲的。。
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p*****m
发帖数: 7030 | 48 patpat 这个确实太要看运气了 而且步步都要看运气
【在 a***a 的大作中提到】
: 我就准备着裸体defense了，如果老板让的话。。。
: 关键还是看命，有人的晶体眼皮底下眼看着就长出来了。。。
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p*****m
发帖数: 7030 | 49 哪番话？说来看看 话说看来你和我年级差不多啊
【在 a***a 的大作中提到】
: 我4年前也很骄傲，还常常引用丘吉尔表扬伦敦空战飞行员的那番话激励自己
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a***a
发帖数: 40617 | 50 其实现在大部分结构lab水平都差不多。就看拿到constructs的先后
所以才会出现现在比较新的蛋白结构一旦发表，都是前后数个lab一起发
特别难的那是另外一回事，有的从有晶体到结构都花十几年的，里面多少
phd，postdoc的青葱岁月就这么炮灰掉了，荣誉只属于最后那个lucky bastard。。。
【在 p*****m 的大作中提到】
: patpat 这个确实太要看运气了 而且步步都要看运气
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a***a
发帖数: 40617 | 51 Never in the field of human conflict was so much owed by so many to so few
【在 p*****m 的大作中提到】
: 哪番话？说来看看 话说看来你和我年级差不多啊
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p*****m
发帖数: 7030 | 52 I see..
【在 a***a 的大作中提到】
: Never in the field of human conflict was so much owed by so many to so few
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a***a
发帖数: 40617 | 53 还好我现在糟蹋掉的都是美国老百姓的血汗，不是中国老百姓的，我心甚慰
【在 p*****m 的大作中提到】
: I see..
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p*****m
发帖数: 7030 | 54 恩 要说现在的结构牛人是不是都得具备面狠心黑的特质?我觉得我就下不了手把一个解
出来就能拿nobel的蛋白十几年如一日的让手下人去解
【在 a***a 的大作中提到】
: 其实现在大部分结构lab水平都差不多。就看拿到constructs的先后
: 所以才会出现现在比较新的蛋白结构一旦发表，都是前后数个lab一起发
: 特别难的那是另外一回事，有的从有晶体到结构都花十几年的，里面多少
: phd，postdoc的青葱岁月就这么炮灰掉了，荣誉只属于最后那个lucky bastard。。。
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a***a
发帖数: 40617 | 55 这不是悲剧，悲剧的是中间死掉的那些炮灰，也许都improve了一些东西
但是这些东西都不能发表，以免失去这场赛跑的领先优势
【在 p*****m 的大作中提到】
: 恩 要说现在的结构牛人是不是都得具备面狠心黑的特质?我觉得我就下不了手把一个解
: 出来就能拿nobel的蛋白十几年如一日的让手下人去解
|
a***a
发帖数: 40617 | 56 你这个不够黑
最黑的是有学霸一旦从会议上听说某个蛋白有晶体了，立刻让手下几个postdoc联手
去搞，最后反而比别人还先发表
【在 p*****m 的大作中提到】
: 恩 要说现在的结构牛人是不是都得具备面狠心黑的特质?我觉得我就下不了手把一个解
: 出来就能拿nobel的蛋白十几年如一日的让手下人去解
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X***n
发帖数: 366 | 57 那土鳖constructs有没有啥共性？
【在 a***a 的大作中提到】
: 的确碰到过一些土鳖constructs，涂整整1ml的转化，最后就2，3个colonies
: 对了，不要涂太浓，也会有问题
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a***a
发帖数: 40617 | 58 没啥，总之constructs这玩意儿，有些时候的确是不按常理出牌的
我还碰到过一冻就有问题的。。。
【在 X***n 的大作中提到】
: 那土鳖constructs有没有啥共性？
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p*****m
发帖数: 7030 | 59 牛 不过这种恶习就不限于结构lab了
【在 a***a 的大作中提到】
: 你这个不够黑
: 最黑的是有学霸一旦从会议上听说某个蛋白有晶体了，立刻让手下几个postdoc联手
: 去搞，最后反而比别人还先发表
|
p*******r
发帖数: 4048 | 60 我建议你直接送到公司去， 人家300块钱给你解决了。 你自己浪费2个星期，划不来。
【在 X***n 的大作中提到】
: 牛！
: 敢问牛人把7.5 kb的insert连到4.7 kb的500 copies per cell的质粒中是否可能？用
: DH 10B chemocompetent cell行不？
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p*******r
发帖数: 4048 | 61 我都没有ld。。。
我也羡慕一把，呵呵。
【在 s*******y 的大作中提到】
: 身边不多，偶ld也不是做这个的，帮不上我，呜呜
|
p*******r
发帖数: 4048 | 62 嗯， 我们都这样。 老板说了，我一个星期要给你1000块工资。 你觉得比这便宜你就
送公司。
【在 a***a 的大作中提到】
: 我是心里有感触
: 就是因为老中太能干了，老板才把我们当cheap labor用到死
: 后来老美都是直接送公司
: 所有序列都是合成的，连载体，转化全部自动化
: 最后还是high thru put跑个大SDS PAGE precast gel
: 人基本不干啥事，就几十个几十个筛了
: 所以说，千万别显得自己能干
|
w***a
发帖数: 1053 | 63 关键是插入片段的浓度，这么大pcr最后产物浓度就会低，浓度低连接效率会大大下降
，总之，浓度越大越好。 |
p*******r
发帖数: 4048 | 64 嗯， mcKinnon. :)
Successfully got the Nobel prize with this strategy.
【在 a***a 的大作中提到】
: 你这个不够黑
: 最黑的是有学霸一旦从会议上听说某个蛋白有晶体了，立刻让手下几个postdoc联手
: 去搞，最后反而比别人还先发表
|
p*******r
发帖数: 4048 | 65 我觉得楼主应该提纯了呀？
【在 w***a 的大作中提到】
: 关键是插入片段的浓度，这么大pcr最后产物浓度就会低，浓度低连接效率会大大下降
: ，总之，浓度越大越好。
|
e****s
发帖数: 1125 | 66 有道理，
我从来不大在乎什么3:1的比例，
一直是能多加Insert就多加点，特别是PCR酶切产物。
【在 w***a 的大作中提到】
: 关键是插入片段的浓度，这么大pcr最后产物浓度就会低，浓度低连接效率会大大下降
: ，总之，浓度越大越好。
|
m**********2
发帖数: 6568 | 67 你不如敬仰我。我都是高通量克隆，每天96X8=768个constructs
【在 s*******y 的大作中提到】
: 敬仰之情滔滔江水~~~~~~
: 小菜鸟飘过
:
: 做过300个constructs的飘过
|
e****s
发帖数: 1125 | 68 有道理，
我从来不大在乎什么3:1的比例，
一直是能多加Insert就多加点，特别是PCR酶切产物。
【在 w***a 的大作中提到】
: 关键是插入片段的浓度，这么大pcr最后产物浓度就会低，浓度低连接效率会大大下降
: ，总之，浓度越大越好。
|
D*********t
发帖数: 370 | 69 This is very difficult. I don't think I've done 4-fragment ligation (large
fragments!). You may try to
use a shuttle. E.g., put two of them into pKS first. Then ligate another
one. Then you cut out a
(big) single fragment and ligate with your vector. Someone may have
suggested this, I didn't read
all the posts.
【在 X***n 的大作中提到】
: 5.5, 6.5, 7.5 kb三个片段， PCR 能出来。链接到4.7 kb的pHcRed1-C1 载体里，出来
: 的都是空的。pHcRed1-C1是高拷贝质粒，是不是因为太大了不能有效复制？
|
a***a
发帖数: 40617 | 70 你果然中文不行，我看用英文是被逼的
large
【在 D*********t 的大作中提到】
: This is very difficult. I don't think I've done 4-fragment ligation (large
: fragments!). You may try to
: use a shuttle. E.g., put two of them into pKS first. Then ligate another
: one. Then you cut out a
: (big) single fragment and ligate with your vector. Someone may have
: suggested this, I didn't read
: all the posts.
|
|
|
m**********2
发帖数: 6568 | 71 I don't think OP was that advanced. He was trying to make 1 construct with
each of the inserts, not all inserts into 1 construct.
large
【在 D*********t 的大作中提到】
: This is very difficult. I don't think I've done 4-fragment ligation (large
: fragments!). You may try to
: use a shuttle. E.g., put two of them into pKS first. Then ligate another
: one. Then you cut out a
: (big) single fragment and ligate with your vector. Someone may have
: suggested this, I didn't read
: all the posts.
|
D*********t
发帖数: 370 | 72 FT...
【在 m**********2 的大作中提到】
: I don't think OP was that advanced. He was trying to make 1 construct with
: each of the inserts, not all inserts into 1 construct.
:
: large
|
b******y
发帖数: 203 | |
n****e
发帖数: 1677 | 74 用LIC plasmid吧，不用酶切，PCR完直接连。
【在 X***n 的大作中提到】
: 牛！
: 敢问牛人把7.5 kb的insert连到4.7 kb的500 copies per cell的质粒中是否可能？用
: DH 10B chemocompetent cell行不？
|
T****r
发帖数: 4006 | 75 不大，出来的都是空载体说明你vector没有处理好，或者发生了自连，酶切时间长一点
，之后用CIP处理，跑胶速度慢点，跑久一点让分离效果好点.....小地方要注意，处理
的干净整齐，还有看看你competent cell的效率是不是好...这个的影响是很大的..
【在 X***n 的大作中提到】
: 5.5, 6.5, 7.5 kb三个片段， PCR 能出来。链接到4.7 kb的pHcRed1-C1 载体里，出来
: 的都是空的。pHcRed1-C1是高拷贝质粒，是不是因为太大了不能有效复制？
|
d****h
发帖数: 46 | 76 How do you double digest vector and PCR product with SacI(buffer1 100%,
Buffer3 10%) and SalI(Buffer3 100%, buffer1 0%), sequentially or
simultannously? If you do it simultaneously, both theoretically and
practically(maybe in your case), it won't work.
I made 50 constructs in the past 2 month. In my experience the propotion (of
insert and vector)and ligation condition are not that important, you just
need fragments in good quality.
Never use CIAP unless you have to.
【在 X***n 的大作中提到】
: 惭愧。我是postdoc，实验室里就我一个人做分生。
: 双酶切， SacI和SalI，没有CIP处理。
: 这种情况下3：1链接过夜没问题吧？
: 只是想问问版上是否自己的设计本身就不合理。
: 主要是另外7个小的都出来了，这三个耽搁太久了。有些急。
|
b**y
发帖数: 70 | 77 保证片段和载体的质量，还不容易出来的话直接扔4度3-5天。 |
X***n
发帖数: 366 | 78 Sorry, I did not make it clear. They are three different clones.
I do want to try clone two fragments into one construct at one time. But
they are shorter than 1 kb. It will be very easy when using SLIC.
(large
another
【在 D*********t 的大作中提到】
: This is very difficult. I don't think I've done 4-fragment ligation (large
: fragments!). You may try to
: use a shuttle. E.g., put two of them into pKS first. Then ligate another
: one. Then you cut out a
: (big) single fragment and ligate with your vector. Someone may have
: suggested this, I didn't read
: all the posts.
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X***n
发帖数: 366 | 79 我就是因为用LIC/SLIC给养懒了，没耐心好好试传统方法了。
所以自己在平心静气，老老实实地做。
顺便问一下，我用SLIC最大也就能插入3kb的到3.7kb的载体里。你呢？这个方法对
insert大小太敏
感了。你以为呢？
【在 n****e 的大作中提到】
: 用LIC plasmid吧，不用酶切，PCR完直接连。
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X***n
发帖数: 366 | 80 Sorry啦。SacI和SalI是顺序切的。其实7.5k的那个是SalI和BglII，使双酶切。
我是该保证酶切的质量。谢谢指教！
//bow
(of
just
【在 d****h 的大作中提到】
: How do you double digest vector and PCR product with SacI(buffer1 100%,
: Buffer3 10%) and SalI(Buffer3 100%, buffer1 0%), sequentially or
: simultannously? If you do it simultaneously, both theoretically and
: practically(maybe in your case), it won't work.
: I made 50 constructs in the past 2 month. In my experience the propotion (of
: insert and vector)and ligation condition are not that important, you just
: need fragments in good quality.
: Never use CIAP unless you have to.
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P******B
发帖数: 65 | |
X***n
发帖数: 366 | 82 That's SLIC method.
Although I did not try using kit, I can success in cloning others smaller
than 4 kb. I cannot get it successful to clone these larger fragments using
SLIC. Maybe I should try with SLIC kit like this one.
Thanks.
【在 P******B 的大作中提到】
: http://www.genscript.com/
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h*********9
发帖数: 361 | 83 不算用Gateway system, 俺的纪录是2个周，overlap PCR 一次成功克隆36 out of 40
genes，3个月内一次性成功做出 21个 insertional KO.
const
【在 p*****m 的大作中提到】
: 啊哦 我印象里你不是做结构的 那这就不奇怪了 我家LD本科时候就有3个月100个const
: ruct的壮举。。
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n********k
发帖数: 2818 | 84 May I ask for ur protocol, thanks...BTW, by insertional KO, u mean using
retroviral like that, right?
40
【在 h*********9 的大作中提到】
: 不算用Gateway system, 俺的纪录是2个周，overlap PCR 一次成功克隆36 out of 40
: genes，3个月内一次性成功做出 21个 insertional KO.
:
: const
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h*********9
发帖数: 361 | 85 No, totally different. site/gene-specific insertion by homologous
recombination.
【在 n********k 的大作中提到】
: May I ask for ur protocol, thanks...BTW, by insertional KO, u mean using
: retroviral like that, right?
:
: 40
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n********k
发帖数: 2818 | 86 That's super, u deserve a raise:)))...so may i have your super protocol...
might need to do a lot of
knockout/knockin sometime in my future
【在 h*********9 的大作中提到】
: No, totally different. site/gene-specific insertion by homologous
: recombination.
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s*******y
发帖数: 2366 | 87 ld会有的...
【在 p*******r 的大作中提到】
: 我都没有ld。。。
: 我也羡慕一把，呵呵。
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s*******y
发帖数: 2366 | 88 可以...
可是这么多怎么做得了...
【在 m**********2 的大作中提到】
: 你不如敬仰我。我都是高通量克隆，每天96X8=768个constructs
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h*********9
发帖数: 361 | 89 I did it 4-5yr ago and do not have specific protocol in hands, I will post a
general role for gene cloning later...
【在 n********k 的大作中提到】
: That's super, u deserve a raise:)))...so may i have your super protocol...
: might need to do a lot of
: knockout/knockin sometime in my future
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n********k
发帖数: 2818 | 90 thanks a lot...
a
【在 h*********9 的大作中提到】
: I did it 4-5yr ago and do not have specific protocol in hands, I will post a
: general role for gene cloning later...
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f**u
发帖数: 346 | 91 嗬嗬，既然说到突变率了，各位有什么好主意降低这个吗？
我用taq曾经有过400bp出现4个点突变的纪录，用的是标准条件，不是error prone，
好在是做probe，没怎么去管它，如果是做KO什么的不堪设想。
有时候用pfx扩不到1k的片段也能出突变，不光是点突变，还出过frameshift，
反正感觉我做PCR突变就特别多。
【在 a***a 的大作中提到】
: 啥酶都能P那么长，关键是看突变率
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n********k
发帖数: 2818 | 92 I used primestar from Takara, it is great with my experience...no denaturing
reagents though, otherwise any
Polymerases(I have ever used) would do poorly...
【在 f**u 的大作中提到】
: 嗬嗬，既然说到突变率了，各位有什么好主意降低这个吗？
: 我用taq曾经有过400bp出现4个点突变的纪录，用的是标准条件，不是error prone，
: 好在是做probe，没怎么去管它，如果是做KO什么的不堪设想。
: 有时候用pfx扩不到1k的片段也能出突变，不光是点突变，还出过frameshift，
: 反正感觉我做PCR突变就特别多。
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p**********t
发帖数: 2636 | 93 PrimeStar is a really sensitive enzyme. It fails my PCR a lot of the time...
Don't know why. BTW I use Takara ExTaq for my regular PCR, using shorter
priming time for PrimeStar then it stops working.
denaturing
【在 n********k 的大作中提到】
: I used primestar from Takara, it is great with my experience...no denaturing
: reagents though, otherwise any
: Polymerases(I have ever used) would do poorly...
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n****e
发帖数: 1677 | 94 I don't think there is a limitation of the insert with LIC as long as you
can complete the PCR.
Though I have not done any cloning with insertion >3kb.
【在 X***n 的大作中提到】
: 我就是因为用LIC/SLIC给养懒了，没耐心好好试传统方法了。
: 所以自己在平心静气，老老实实地做。
: 顺便问一下，我用SLIC最大也就能插入3kb的到3.7kb的载体里。你呢？这个方法对
: insert大小太敏
: 感了。你以为呢？
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n********k
发帖数: 2818 | 95 yes and no, without knowing the details of your problems. once u can get it
very robust, it shall be very
reliable..u likely need a good PCR machine since the annealing time is so
short...I always do it with our best
cycler...if ever I had to do with the older ones, I would compensate for the
time say setting as 1-3 sec rather
than 5-10 sec...because the ramp time would just kill the specificity...BTw, it is becoming challenging if the
fragment is bigger than 3k esp over 4kb...(with genomic DNA
【在 p**********t 的大作中提到】
: PrimeStar is a really sensitive enzyme. It fails my PCR a lot of the time...
: Don't know why. BTW I use Takara ExTaq for my regular PCR, using shorter
: priming time for PrimeStar then it stops working.
:
: denaturing
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X***n
发帖数: 366 | 96 I want your super protocol too, superperson.
【在 n********k 的大作中提到】
: That's super, u deserve a raise:)))...so may i have your super protocol...
: might need to do a lot of
: knockout/knockin sometime in my future
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X***n
发帖数: 366 | 97 How big is your targeting vector?
【在 h*********9 的大作中提到】
: No, totally different. site/gene-specific insertion by homologous
: recombination.
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J******6
发帖数: 18 | 98 After PCR, do TA cloning first and then cut the inserts out for ligation
with your vector.
It shoud be helpful to treat the vector fragment with CIP beforhand.
【在 X***n 的大作中提到】
: 5.5, 6.5, 7.5 kb三个片段， PCR 能出来。链接到4.7 kb的pHcRed1-C1 载体里，出来
: 的都是空的。pHcRed1-C1是高拷贝质粒，是不是因为太大了不能有效复制？
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s*******y
发帖数: 2366 | 99 我也总是先TOPO TA
PCR产物酶切效果总是不好:(
【在 J******6 的大作中提到】
: After PCR, do TA cloning first and then cut the inserts out for ligation
: with your vector.
: It shoud be helpful to treat the vector fragment with CIP beforhand.
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d****h
发帖数: 4291 | 100 杯具啊
我每天都看着对门lab的一车一车的推培养基
然后一车一车的推去离心
一个晶体下面也不知道埋了多少炮灰 |
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s***m
发帖数: 6197 | 101 是不是太大了DNA容易被shear？
一般这么大的片段不是用cosmid或者fosmid吗？
【在 X***n 的大作中提到】
: 5.5, 6.5, 7.5 kb三个片段， PCR 能出来。链接到4.7 kb的pHcRed1-C1 载体里，出来
: 的都是空的。pHcRed1-C1是高拷贝质粒，是不是因为太大了不能有效复制？
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f**u
发帖数: 346 | 102 很好奇，目前还有这样的蛋白吗？大家说说。
【在 p*****m 的大作中提到】
: 恩 要说现在的结构牛人是不是都得具备面狠心黑的特质?我觉得我就下不了手把一个解
: 出来就能拿nobel的蛋白十几年如一日的让手下人去解
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