p*****c
发帖数: 116 | 1 谢谢回复！是在293 细胞株上找到的，本来是用来做正常对照的。
现在也不知道下一步该怎么做？ |
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a********k
发帖数: 2273 | 2 细胞株还怕intron mutation？！那只能说这个mutation太太太强大了 |
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p*****c
发帖数: 116 | 3 好像细胞株活的好好的？
跟intron mutation和谐共存呢。 |
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v*******a
发帖数: 759 | 4 想起当年Judah Folkman意外身亡，差点哭出来。本来合作的东西都快写文章了，结果
几个关键的细胞株就在混乱中不知去向，合作联系的薄厚也找不到了，就此不了了之，
可惜啊 |
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d**********2
发帖数: 103 | 5 大虾们好。。。
小弟最近在转染293T来筛选能激活CASPASE3 的蛋白。。。
先是用了promega 的Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay来检测caspase 3
激活。。。
但是负对照和staurosporin 处理的细胞没有区别。。。
转而用santa cruz 的caspase 3 抗体（caspase-3 (H-277): sc-7148）检测p17/p19
也未果。。。只能见到全场的
caspase 3 。。。staurosporin 浓度1ug/ml, 5H 。。。都可以看到细胞明显的形态变
化了。。。甚至看到细胞内很多小
泡泡。。 (凋亡小体)？...
迷茫啊。。。各位觉得是抗体/试剂盒/细胞株还是staurosporin有问题呢？请各位不吝
赐教啊。。。。
谢谢～～ |
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b**********8
发帖数: 349 | 6 小弟PhD第二年，一直在郁闷中度过，几度想退学，但是有没有后路，只得煎熬。
废话少说，言规正传吧，不知道大家有没有经历过这种情况。我们的project最初发现
一个基因（暂且称之为A）在肝癌组织和细胞株中普遍高表达，用shRNA方法敲出这个基
因后发现另一个与生长增殖有关的基因（称为B）表达水平也显著下调，在多个肝癌细
胞株里都能重复到这一结果，于是继续深入做了很多功能方面的研究。这一工作主要由
我前面的师姐完成，已经准备毕业答辩，文章也在修稿中，差不多快接受了。我来了后
老板让我继续研究A调节B的机制。后来因实验需要从Dharmacon公司买了针对A基因的
siRNA,是那种smartpool，就是四合一的那种，回来转染细胞后发现对A基因的沉默效率
几乎百分之百，但是不论怎样变换实验条件，就是观察不到原来对基因B的抑制效果，
从转染后第2天，一直到12天，中间还做过double transfection，始终没有结果。后来
实在没办法，把以前shRNA的序列发给Dharmacon公司，让他们合成siRNA,然后又能重复
到以前的现象。
我现在怀疑前面的A调节B的发现很可能是shRNA... 阅读全帖 |
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b**********8
发帖数: 349 | 7 谢谢楼上各位的意见和建议，特别感谢sunnyday战友的意见，或许我和老板交流的确实
不够，每次只是简单地汇报下data，此物鲜有更深层次的交流，当然这也有我不善于表
达和交流的责任在里面，以后尽量争取做得更好些。另外，还要感谢juicemaker战友的
建议，如你所言，我们的确也已经在着手准备构建inducible shRNA expression
system，不过我们采用的是Clontech公司的pSingle-tTS-shRNA system，而且准备用这
个建立稳定克隆然后在小鼠体内进行相关实验。
扯远了，如前文所述，我现在发现siRNA 敲掉A基因后，在两个细胞株中都观察到B基因
半衰期有显著缩短，但是B基因3'UTR的luciferase报告基因实验却无差别。所以我现在
的问题是，假设A能增加B的转录产物的稳定性这一现象是真的，但是又不是通过3’UTR
这个环节的话，那么还有哪些环节可以考虑呢？分别可以用那些实验技术来验证呢？我
看了一些关于mRNA stability方面的文献，发现影响mRNA stability的因素太多了，这
样的话我的课题又陷入了一个新的寻找机制... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 8 对于第一个，你的做法是正确的。不同实验室的不同细胞株对药物敏感型不一样。
对于第二个，各有各的道理。２４孔板每个孔细胞多，偏差是会小一些，对于
后续的生化试验因为样品量大一些也会准一些。但是９６板可以一个板上作
好几个重复，所以平均下来后并不比２４孔的差多少。尤其是对于做ELISA
而言，其实96孔板反而更好（因为探头很小，多出来的地方反正探不到）
不过，９６孔板的孔小，溶液表面张力明显，对于那些对环境敏感的细胞不好。
不知道你们的神经细胞是否属于这样的范围？ 对于那些特别大或者特别长的
细胞（比分说某些神经元细胞），的确是大孔板好一些。
6
chemical |
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h*****4
发帖数: 1158 | 9 国内公司招你做神马！？
你能带回去神马！？技术，经验，劳动力，还是菌株细胞株！？ |
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j****x
发帖数: 1704 | 10 不见得，PEI也算是homemade，从公司（一般推荐sigma吧）买粉末自己回来配，调一下
pH就可以用了，这点和Calcium Phosphate倒是很像，但是一来配制的pH的要求没那么
严格简单很多，二来毒性小一些，细胞谱也似乎更广一些，在不少细胞上效果据说可能
好一些，三来DNA/siRNA通吃，效果都不错。目前做高通量转染可以算首选，除非细胞
特殊。
Tranit的试剂其实是抄的Fugene的专利，成分其公司的技术支持直接告诉我和Fugene6
一样，所以用法用量都不用再作优化如果之前用的就是fugene6。价格相对Fugene6便宜
一些，但如果用量很大，还是不够经济。
Calcium Phosphate转染效率低基本就一个原因，complex形成的不够好。假如混匀之后
看不见雾状浑浊，那就可以直接扔掉不必浪费时间和细胞了。原因自然有很多，核心前
面大家都提了是pH的问题，有时候公司的KIT也信不过，我有同事就被promega坑过，换
了Invitorgen才正常点，再后来就再也不用了，因为价格也很贵，自己配又不是放心。
Roche最近新推了真正自己的转染试剂X-treme... 阅读全帖 |
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a****d
发帖数: 1919 | 11 Konrad Hochedlinger 去年的nature文章已经做过iPSC和ESC之间的比较，结论是大部
分的iPSC和ESC并不相同，但是有一部分iPSC和ESC表型趋于identical（根据他们所设
定的比较标准）。选择与ESC最相近的iPSC细胞株，才有希望更好的用其代替ESC进行相
关研究。不知道这篇文章之中，作者是否像Konrad那样选择出与ESC最相近的iPSC来研
究免疫排斥，如果使用了Konrad筛选出来的几株iPSC，依然还会导致机体免疫排斥的话
，那就非常有意思了。如果作者只是制备出若干iPSC，然后研究免疫排斥，得到与ESC
移植有区别的表型，也是正常不过的。
的免疫排斥。但是由该老鼠系制备的胚胎干细胞就没有这个问题。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 12 有的问题已经在别的帖子里发过了，但是关注度不够，到现在没得到答复，现在贴到这
里归个总，大家一定要帮帮我，凡是看过这个帖子的都给我点意见吧，特别是艳阳天MM
啊，Oncogene版主啊，给点权威的意见吧，小弟先谢谢你们了
问题1，
最近做dual luciferase reporter assay，主要是想看在癌细胞中敲除某一基因A后，
对另一基因B启动子活性的影响。（已经证实敲除A后能下调B的mRNA转录和翻译表达）
。我尝试过两种不同的转染顺序，如下：
1）24 well plate铺板，第二天转染A的siRNA,第三天转染B的启动子报告基因质粒，第
四天收细胞assay，发现siControl和siA的renilla的读数相差很大，有时能达到10倍左
右，出来的ratio也经常是千奇百怪，忽高忽低，难以解释，
2）考虑到可能是先转染siRNA会影响后续质粒的转染效率。于是换方案，先在6孔板中
铺板，第二天转染质粒，过夜后换液，转染24小时候胰酶消化，将细胞铺到24孔板中，
24小时后再分别转染siControl和siA，出来的结果漂亮多了，至少data不像前一种方案
那么难看了。... 阅读全帖 |
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a********p
发帖数: 94 | 13 在Hela之类的比较好养的细胞中表达一个酶，用CMV之类的质粒，如果wt中有这个酶的
表达，但是
不高，那么转染筛选之后能得到一个比较高的表达么，比如10fold或者100fold higher
？ 还是说
这个问题要具体情况具体分析，如果这个酶的高表达对细胞生长或者生存不利，那么很
可能就得不
到比较高表达的细胞株？
新手诚心请教 |
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s**u
发帖数: 9035 | 14 海外招聘启事
多名海外优秀药理学专家及新药开发专家与中科院上海药物研究所（位于上海张江
高新区）合作组成药物创新团队，致力于推动药理基础科学向创新药物的转化。因工作
需要，现面向海外招聘博士后或博士助理研究员一名，欢迎在海外已取得博士学位或博
士后有志于药物创新及产业化的青年才俊加入。
博士后或博士助理研究员一名
药物创新团队博士后或博士助理研究员直接接受海外专家教授指导、培训，接触世
界药物创新研发前沿，有广泛国际交流机会，待遇从优。研发方向为人源性抗体药物的
筛选和鉴定。
应聘条件：
1. 分子生物学、细胞生物学、药理学或相关专业博士毕业；
2. 具有分子克隆、噬菌体表达、细胞培养、蛋白质纯化、抗体药物筛选等方面经
验的优先考虑，其具体经验包括（但不限于）各种分子生物学技术，重组蛋白表达载体
设计和优化，各种重组蛋白表达系统，噬菌体表达文库的构建和筛选，重组蛋白质特性
测定，哺乳动物细胞株工程等，能够设计和执行关键的实验；
3. 具有独立开展科研工作的能力，热爱科研事业，富有创业和挑战精神；
4. 工作勤奋、努力，动手能力强，有较强科研组织能力，具有良好的团队协作精
神；
... 阅读全帖 |
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A*****1
发帖数: 1029 | 15 最好在加州湾区
受国内朋友所托想找个实验室做点试验
关于哺乳细胞转化筛选细胞株之类的实验
想问一下美国这边有实验室租借业务么？或者有公司管事的，或者是PI有自己实验室的
，可以商议一下付费租借实验室做实验的可能么？就用一下实验室以及相应的仪器，试
剂什么的都我们自己准备，保证不会给实验室带来负面影响或者任何仪器的损坏，可以
签订协议，损坏赔偿什么的
有人有任何相关的信息么？实在不再湾区也可以，
不胜感激，希望回站内信箱详谈 |
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z********i
发帖数: 610 | 16 可以试试zymed的pSer（现在是invitrogene），purified的多抗，运气好的话能找到一
个好用的。我们买过好几只，其中有很好用的。
sigma的pSer是单抗，信号很弱可以用。
pY很好用，那是因为都是同一个单克隆细胞株，不同的公司名称可能不一样。 |
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j*****d
发帖数: 787 | 17
太佩服你了。你不会是科学松鼠会的吧。
看来这次事件，从RY的愤文，到Lasker间接涉及到老一代科学家，到三氧化二砷，多少
波及到陈竺本人的圈子。
我从一开始就奇怪为什么陈竺还不出来为这个祖国/中药的光荣说点什么。
陈竺：白血病治疗是中药现代化契机
作者：bbioo 来源：《科学新闻》双周刊 浏览：1699 网友评论 0 条
继去年的系列研究后，卫生部部长陈竺和上海血液学研究所所长陈赛娟等于2009年2月
10日与2009年2月18日，在美国《国家科学院院刊》（PNAS）连续在线发表了两篇关于
白血病的研究论文。两项研究分别是“硫化砷和伊马替尼对慢性粒细胞白血病协同作用
的系统生物学研究”[1...继去年的系列研究后，卫生部部长陈竺和上海血液学研究所
所长陈赛娟等于2009年2月10日与2009年2月18日，在美国《国家科学院院刊》（PNAS）
连续在线发表了两篇关于白血病的研究论文。两项研究分别是“硫化砷和伊马替尼对慢
性粒细胞白血病协同作用的系统生物学研究”[1] 和“全反式维甲酸和三氧化二砷联合
治疗新发急性早幼粒细胞白血病（APL）的长期临床疗效和安全性研究”[2]。
硫化砷... 阅读全帖 |
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l*****e
发帖数: 138 | 18 大概看了一下，数据很多．不过我第一反应是，为什么他们要用HepG2 这个肝癌细胞株
做体外试验呢？
of
Jing |
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r***e
发帖数: 2539 | 19 内源性的50kd带出来了？Akt检测还是很简单的，至少在细胞株里。 |
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a*******o
发帖数: 16 | 20 和转的基因、细胞都有关系吧，以前实验室做过twist和hRAS共转的稳转细胞株，很好
做，但是其他的相对就很麻烦，有的就做不出 |
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b***a
发帖数: 147 | 21 从一个细胞株里提的蛋白，IgG做阴性对照，分别测蛋白A和蛋白B，用蛋白C做阳性对照。
结果是，input的lane里面都是干干净净，一点都没有，IgG的lane，可以见到重链，但
是向下的拖影很严重，蛋白A/B/C也是这样，拖影很严重，目的条带似有似无，第一次
做这几个蛋白，据说蛋白C是阳性对照，应该不错 的。
对了，A和B是核蛋白，我提的是总蛋白，就是提取的时候，用裂解液时间长一些，
vortex剧烈些。
觉得奇怪的是，为什么input里面干干净净，IP以后 反而有东西？这不是无中生有么？
我觉得从结果看，Western blot的过程应该没问题的，感觉是IP的问题，拖影可能是洗
脱的不够吧，可是这无中生有就没法解释了，要是一个抗体还可能是什么步骤错了，可
是三个抗体都这样，就奇怪了。。
盼高手指点一二。。。。 |
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h******y
发帖数: 351 | 22 我建议你尝试几种不同的转染试剂，这比尝试DNA和lipofectamine的不同比例效率要高
。特定的转染试剂有时候在你的细胞株中就是不WORK，你怎么试也得不到好的效果。转
染中，DNA的量对结果影响最小，如果你用100ng的BAC DNA，即使是300Kb的大BAC,你也
有几亿个copy了，每个细胞能分到几十万个。
所以我建议你固定DNA的量，改变转染试剂的用量。
常用的转染试剂比如lipofectamine，lipofectamine 2000，FuGene 6， FuGene HD和
PEI都可以拿来试试。按照厂家建议的常用组合，每种试剂试3-4种就行了。这些试剂都
不贵。比起你1个月的时间来，都是小钱。
另外你用的是8-well plate？是不是typo？是6-well？试的时候用24-well就行了，这
样可以节省试剂，而且可以多试几种组合。细胞的接种密度也很重要，多试几个，大致
保证24小时后细胞密度在20-60% （1-3倍的初始接种密度差）。
350 |
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h******y
发帖数: 351 | 23 我建议你尝试几种不同的转染试剂，这比尝试DNA和lipofectamine的不同比例效率要高
。特定的转染试剂有时候在你的细胞株中就是不WORK，你怎么试也得不到好的效果。转
染中，DNA的量对结果影响最小，如果你用100ng的BAC DNA，即使是300Kb的大BAC,你也
有几亿个copy了，每个细胞能分到几十万个。
所以我建议你固定DNA的量，改变转染试剂的用量。
常用的转染试剂比如lipofectamine，lipofectamine 2000，FuGene 6， FuGene HD和
PEI都可以拿来试试。按照厂家建议的常用组合，每种试剂试3-4种就行了。这些试剂都
不贵。比起你1个月的时间来，都是小钱。
另外你用的是8-well plate？是不是typo？是6-well？试的时候用24-well就行了，这
样可以节省试剂，而且可以多试几种组合。细胞的接种密度也很重要，多试几个，大致
保证24小时后细胞密度在20-60% （1-3倍的初始接种密度差）。
350 |
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v*********d
发帖数: 382 | 24 Ectopic expression 经过几代后很容易就被silence掉了。
你的construct 如果是transient expression, 有没有GFP? 如果有
1，你现在的细胞株可以试一下染色，看看能不能检测到
2，从新做, 挑有GFP的单克隆， 再做个western 看看对不对 |
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s******s
发帖数: 13035 | 26 为啥一定要g418? 你做啥的，问的问题这么诡异？ |
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m*******n
发帖数: 387 | 31 如果不用retrovirus，直接转个质粒进去，用puromycine筛的话
这种stable cell line，基因是在基因组上吗？ |
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w******n
发帖数: 767 | 32 High dilution to get monoclonal cell population,then check one by one. |
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p********e
发帖数: 61 | 33 WB抗体最重要，其他都次要。话又说回来，在哪儿抗体不重要呢？ELISA, IP, Flow,
IHC, ChIP, ChIP-seq, Fluorescence Microscopy.......如果抗体好，手笨点，硬件
差点，都是能做出来的。如果抗体不行，上帝他老人家来了也没辙。
其实生物男很多时间都花在尝试不同的抗体，求老板买更多抗体，以及向抗体公司投诉
上了。
可是如何选抗体呢？哥根据自己的经验体会，给大家提点建议。
在美国有300多家卖抗体的公司，全世界范围就更多了。可是我们常接触的就那么几家
。我把他们分成两类："包罗万象型"和"少而精型"。
最著名的“包罗万象型”公司有三家：AbCam, Sigma和Santa Cruz。这三位的产品也太
全了，无论你需要什么抗体，他们都有。至于是否能用，那就再说了。 我个人的经验
是：能用率大约有20％。 所以我很奇怪楼主会觉得AbCam抗体质量好。这三位大哥中
SantaCruz还算好点，毕竟便宜得多，给的量又足。万一赶上你走运遇到一支好的抗体
，够你用到当正教授了。
据我所知，AbCam和Sigma都不生产抗体，所有抗体都是来自OEM... 阅读全帖 |
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w******y
发帖数: 2504 | 34 请问大家作肝细胞体外实验的时候是用HEPG2细胞株吗？如果想原代培养的话，是否困
难？能否分享一下您的技术心得？ |
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g***y
发帖数: 201 | 35 因为实验要用到A431 human epidermoid carcinoma cell line,
所以几个星期前从ATCC买了，发现运到的frozen vial 已经被一种真菌感染。
现在在跟他们交涉。请问有没有实验室从其他地方买这个细胞株，长势健康的？
我们实验室一直从ATCC订细胞，从来都不错，不知道这次倒了什么霉运了。
如果其他地方／公司口碑比较好的，希望推荐。
多谢。 |
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l**x
发帖数: 52 | 36 谢谢，准备问问看周边谁有没有这个细胞株，弄点来试试。 |
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l**x
发帖数: 52 | 37 不知道原来siRNA对老鼠的细胞株效果不好
transfection. |
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f*****f
发帖数: 195 | 38 不是siRNA对老鼠细胞株效果不好，而是因为C2C12或primary myoblast转染效率偏低，
但也有人转染siRNA成功了的。
可以用病毒转染miRNA质粒，
或者脂质体转染后加质粒抗性标记筛选（如puromycin等）效果也很好。 |
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r**********g
发帖数: 15 | 39
我把细胞消化的挺好， 但就是做不成细胞株， 最多道6－7代就死了， 有什么诀窍吗
？ 谢谢 |
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b****r
发帖数: 17995 | 40 这个我基本同意
到了晚期，相当一部分癌症细胞都嗯已经极多突变，极多不同细胞株混在一起，可以说
已经不可能通过数种药物覆盖了。总不可能同时给病人几十上百种药物
1/ |
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k******0
发帖数: 1073 | 41 蛋白质溶液，随身带一两天没有问题。干嘛冷冻？要吗，真空干燥。
邮寄细胞株的可以麻烦了。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 42 多谢楼上各位的回复，特别是clonebar站友的意见很实在面对我启发很大。
我们已经在细胞株里做了一些初步的实验，发现敲出这个基因后细胞增殖减慢，同时有
G1 cell cycle arrest。当然这些只是一些初步的data，还需要不断验证和深入。再次
谢谢大家的意见和建议。 |
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t*****2
发帖数: 213 | 43 这个问题还是要先搞清楚的。是拿什么和什么比的？如果如你所说是混合物，那stroma
的高表达和parenchyma高表达要回答的问题和假设明显是完全不同的。
如果是stroma，那为什么stroma作为非肿瘤细胞会有该蛋白的高表达？是个体差异还是
肿瘤特异的？你在细胞株里作了一些功能，但你不是在癌旁发现高表达的吗？这不是肿
瘤细胞本身阿
？你要敲也要在stroma里敲阿？
有没有hypothesis，在这个情况下还是很关键的。有那么一群人，当然不是说你，作之
前不清楚为什么这么作，尤其是那些sb md，发文章靠堆一堆垃圾data. |
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b**********8
发帖数: 349 | 44 对这个领域不是太了解，请问有没有稳定传代培养的stroma细胞株？特别是人肝脏特异
的,
stroma |
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m*****n
发帖数: 5245 | 45
Satorius性能最好，价格也最贵；
Applikon性能稍差，价格要低一些；
NBS性能一般，价格更低；
GE Wave性能稍差，主要是不容易控制，价格最便宜。
这个取决于你的起始体积，一般建议接种密度5E5每毫升
取决于细胞株，可以先尝试一般的CHO培养基。 |
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h******y
发帖数: 351 | 46 不明白你为什么一定要用immortalized的MEF。因为上述MEF需要克服p53和Rb两个通路
对细胞分裂的共同抑制，MEF需要产生很多基因突变，所以自发immortalization的几率
很小。如何你想同时获得immortalized的野生型和KO的MEF，你的两株细胞的各自
immortalization是两个独立的事件，即使你能获得immortalized的细胞株，他们之间
也已经不能作为参照了。 |
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j******n
发帖数: 941 | 47 1、puromycin作用时间有时候会比较慢，视细胞株而异，建议做1个礼拜左右观察。建
议使用100%抑制的最低浓度，否则很可能混入假阳性克隆。
2、我一般3-5天换一次液。 |
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m*b
发帖数: 1421 | 49 顺路问一下有个蛋白想要搞几株单抗
这个需要多少钱？公司会提供单抗细胞株吗?
谢谢！ |
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p*****u
发帖数: 191 | 50 乙肝，国病，在过去里程碑式的研究发现中没有一个源于国内科学家的发现，无论
是病原发现、基因克隆、还是疫苗开发、或者治疗性的药物。北生所的李文辉课题组发
现乙肝新受体：NCTP基因，这个是一个有意义的研究，但是这个研究是里程碑式的发现
吗？是独一无二的开创，还是众多研究发现中的其中一员，新浪微博上有一位传染病专
家这样评论“一篇文章而已”。
从临床和疾病控制角度来说，控制乙肝的关键依然是提高疫苗接种的覆盖程度，这
是对群体最有效的方法，更多的精力和物力应该集中到提高疫苗保护率，降低疫苗失败
的研究原因中去。对于现症的慢乙肝患者，更重要的是提高医保的覆盖面积，让更多病
人有条件接受规范的、长疗程的抗病毒治疗。对于肝硬化和肝癌的患者，更重要的采用
综合的治疗措施，主要是外科方法来延长生命。正如10年前出现的SARS，传染病隔离措
施的重要性远远超越病原学研究。这些是大范围的政府和政策行为，卫生部的最大的工
作目标就是让每人每年享有300元的卫生服务。
饶毅教授近期对乙肝的研究进展进行了非常好的描述，饶教授列举了乙肝里程碑的
发现、列举了国内科学家在乙肝动物模型研究中的重... 阅读全帖 |
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