s********r
发帖数: 312 | 1 佩服楼主的精神，但这篇文章让我读的悲从中来。WB应该算是生物实验中倒数第二简单
直白的了，倒数第一的是常规的subclone。
当时我在国内读硕士的时候也是一样，什么试剂都没有，自己配buffer，洗玻璃板，配
胶，那破玻璃板还漏，一上午有时候都配不好一块胶，用那种几百块钱的破抗体，买来
之后马上分装好，每个人分那么一丁点，自己的用完了要到处看人脸色借，自己配显影
液定影液，有时候要在暗室里等半个多小时才能看到条带。cloning也是一样，稍微稀
有点的酶都要去隔壁借个几微升回来，感受态细胞自己做，PCR也是连个kit都没有，提
质粒自己配buffer。
楼上有些人说的对，试剂钱是省不下来的。我整个硕士都在纠结这些trouble shooting
，各种做不出来跑不出来，老板指着鼻子说你们这些人分子生物学都是弱智。后来拿到
master赶紧跑路来美国读PhD,前几个月做这些都有心理阴影,洗膜曝光的时候都神经兮
兮的，生怕做不出来。结果WB和cloning怎么做怎么有，慢慢的才对自己恢复了信心。
现在看的那些细胞分子方面的paper，western都是一堆一堆的，cloning更是直接带... 阅读全帖 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 2 同不喜欢TA cloning
都用Blunt PCR cloning
Strategen的blunt PCR cloning kit跟invitrogen的pTOPO-BluntII相比如何？
invitrogen真是很贵很抠门
尤其他们家的感受态细胞
越来越稀有木有
you |
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x*****e
发帖数: 309 | 3 haha,dATP 会不会和片段竞争T，我想也许会，但是不用担心，T4连接酶不会作用在那
种 Vect-T=dATP结构上。 我做Cloning还算顺利，有2个经验供参考：
1.只要条带单一我都是用2倍体积乙醇沉淀回收DNA，吹干后10ul溶解（用kit怎么也得
30ul洗脱，而且跑胶什么的对3'-a 多少有些影响,当然有杂带还是得跑胶回收，最后大
体积洗脱后在用乙醇沉淀浓缩一下).
2.尽可能少的加Vector片段，用高效率的感受态细胞（XL1-blue: stratgene Cat.
200249, >10e8, 如neverthink所说20 ul一个反应就足够了）, 最后也许长出的clone 少，但是阳性率很高，蓝白斑我不用好多年了。
其实，纯粹克隆基因直接加酶切位点，克隆到载体上就行，无须TA克隆。trouble shooting很痛苦，以前有段日子做克隆不顺，后来通过做各种control，发现是新换的Golden View DNA染料的问题，那东西能和单链核酸结合！！！
ditch
many |
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b**********8
发帖数: 349 | 4 还有就是你们用什么感受态细胞转化的？推荐使用stbl3，可以防止质粒重组 |
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b******n
发帖数: 4225 | 5 可以试试看，我觉得应该没什么问题
关键是感受态制备方法 |
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s********8
发帖数: 619 | 6 早就有了,MACH1 cells, 忘了是那个公司的了,不过invitrogen的gateway system就推
荐用这个,我给我们实验室做了很多感受态细胞,还挺好用的,八个小时可以挑菌. |
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b******n
发帖数: 4225 | 7 1. 感受态的问题，是自己制备的还是买的？
2. DNA purification有问题，比如说wash buffer没有处理干净，也就是说还有乙醇残
留，导致连接效率低，转化效率也低
3. 如果是chemical transformation，检查heat shock的温度是不是42度。如果是
electroporation transformation，是不是电击的时候time constant很低，甚至有arc
4. plate的antibiotics种类是不是对，浓度是不是正确
可能的问题很多，最好找老手一步一步教你和帮你trouble shooting。没经验自己分析
很费时费力。 |
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f******p
发帖数: 178 | 8 非常感谢给出一些可能原因。上一个基因克隆的很顺利。换了个基因就开始出问题了。
1. 我是买的感受态细菌。JM109, >10*8
2. 直接克隆的PCR产物。上一个基因就这样, 挺顺利的。再说这个只影响白斑数量吧？
白斑的比例还可以，就是总体数量低。
3. 确定是42度。这个也只影响白斑数量吧？
4. antibiotics没问题
还有可能是什么问题？LB agar两年前的。但两个月前克隆另一个基因还很好啊。
arc |
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x**e
发帖数: 163 | 9 3k多的片段，合成的话应该很贵吧。
一起就10来个ng的产物，也试过上TOPO，因为酶切位点的保护碱基就用的cacc，用的买
的感受态，上不去，怀疑TOPO自身只有2.6k，装不下3k的东西 |
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g***j
发帖数: 40861 | 10 做转化的时候我发现有时候感受态细胞即使没转入带kanamycin的质粒也可以在
kanamycin的平板上生长。
什么道理？ |
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q*******8
发帖数: 768 | 11 平板不新鲜了，抗生素过期，浓度算错，感受态本来就抗kanamycin。。。 |
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S*******r
发帖数: 530 | 13 我连过10kb的片段，invitrogen有一种专门的感受态用于大片段，电转可能好一点，多
做一些连接梯度。
8482; |
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d**********9
发帖数: 981 | 14 本人有过几年的分子生物学的基础，原来作克隆的时候没有遇到过什么大问题，但都是
低于1Kb的PCR产物。但是最近换了一个实验室，一系列分子实验都严重受挫，我也不知
道是什么原因，实在没有招了，多谢高人指点
都是1500bp左右的PCR片断，我在设计引物的时候有在5‘端加了5个bp，PCR都一次能扩
出来，clean-up后酶切，之后再跑胶clean-up，跑了胶确定有条带，还挺亮的。于是跟
相同酶切，CIP处理后，跑胶clean-up的载体相连，室温过夜，也试过16度过夜，但是
transform到商品化的两种不同公司来的感受态细胞之后，都没有克隆出现，几个PCR产
物都是一样的问题
开始觉得可能是PCR产物没有酶切好，尝试先将PCR产物与T载体连接，transform之后也
没有克隆出现
是哪儿有问题，我该如何做？多谢！ |
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b*******H
发帖数: 830 | 15 有一种可能性不能排除：我们实验室遇到过同样现象。
我们号称做克隆最牛，每一次都是教科书级的水平。但有一次一个学生克隆一个怎么也
做不出来，实验员上来也还不行。最后一次偶然机会，用了BL21-plys做感受态细胞，
做出来了。结果发现此蛋白对细菌剧毒，痕量的leaking expression足以杀死细胞。此
结果发在了G&D上了。
还有一种可能： 仔细检查你的引物，很可能有设计失误，一个碱基的错误就会出您这
样的结果，您懂的。如果没有设计错误，重合引物是最佳选择。
GOOD LUCK! |
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W*V
发帖数: 13 | 16 我周一作了四个TRIP-LIGATION 克隆, 筛选都阳性. 今天又作了六个. 集我30年的分
子生物学的工作经验, 我有一套简易,有效的基因克隆方法. 无论片断大小 (>8Kb),
无论酶切类型, 无论何种载体 和感受态细胞, 全都工作,没有问题. 可惜因为版权
关系 (正在写书),其操作步骤现只能非免费提供. 该克隆方法(章节) 转让费为$100.
为证明其可信度,我可以为你作一免费克隆. 你只提供目标片断, 我在三天内交付你
克隆好的质粒. 有兴趣的话,可联系,用此邮箱. |
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W*V
发帖数: 13 | 17 我周一作了四个TRIP-LIGATION 克隆, 筛选都阳性. 今天又作了六个. 集30年的分子生
物学的工作经验, 我有一套简易,有效的基因克隆方法. 无论片断大小 (>8Kb), 无论酶
切类型, 无论何种载体 和感受态细胞, 全都工作,没有问题. 可惜因为版权关系 (正在
写书),其操作步骤现只能非免费提供. 该克隆方法(章节) 转让费为$100.为证明其可信
度,我可以为你作一免费克隆. 你只提供目标片断, 我在三天内交付你克隆好的质粒.
有兴趣的话,可联系,用此邮箱. l******[email protected] |
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B****n
发帖数: 22 | 18 说一点我的经历，或许对楼主有帮助
我去年也在大提pLKO质粒遇到同样的问题，产量很低。因为当时有人警告我说这个质粒
拷贝数很低要摇很多菌，所以我先挑一个单菌落放在5ml培养基里过夜摇，然后转到1L
的大瓶里放大。结果很悲惨。
后来发现没那么邪乎，直接挑一个单菌落放在250ml过夜摇就能提到1-2mg。
我建议：
1.每次都重新转化感受态
2.不要经过小摇，直接单菌落接种 |
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y******s
发帖数: 92 | 19 这个就是片段太大转化效率低的问题
去买个10^9的超级感受态细胞，你的问题立马解决 |
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m*****z
发帖数: 1451 | 20 信息量太少了。载体CIP了吗？什么酶切位点？什么载体？酶切鉴定怎么不对？可能性
太多啦。
我做过9kb+9kb的平末端连接，PUC vector和lentiviral vector都做过，转的是自己做
的感受态，都没有问题。载体要CIP干净，连接要过夜，比例1:1左右。其他没有了。 |
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y******s
发帖数: 92 | 21 这个就是片段太大转化效率低的问题
去买个10^9的超级感受态细胞，你的问题立马解决 |
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m*****z
发帖数: 1451 | 22 信息量太少了。载体CIP了吗？什么酶切位点？什么载体？酶切鉴定怎么不对？可能性
太多啦。
我做过9kb+9kb的平末端连接，PUC vector和lentiviral vector都做过，转的是自己做
的感受态，都没有问题。载体要CIP干净，连接要过夜，比例1:1左右。其他没有了。 |
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C****n
发帖数: 79 | 23 不知道你解决了没有。
昨天做了一个类似的，只不过我是5k + 5k
I assume 你gel extraction是干净彻底的
我用的molar ratio 是1:1，我不知道你为什么要用3:1或者其他的。为什么一定要认定
一个是insert，而另一个是plasmid呢，为什么不能换一下？
我用的是NEB的普通T4 DNA ligase， 连接1小时（普通的我一般是连接20min，也值按
照Protocol上说的），因为片段比较大。
I assume 你的感受态是没有问题的。
最后我提醒一下你，有时候酶切验证会失败，原因是不你克隆失败，而是其他原因，比
如甲基化。
Touble-shooting一下，不要漫天考虑太多的因素。
Hope it helps. |
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n****k
发帖数: 516 | 24 最近经常做差不多大小的片段连接，可以参考下我的条件
1.载体去磷酸化
2.高效率感受态细胞
3.insert:vector大概6:1-9:1
4.足够的DNA，我10ul体系里面大概加100ng
5.我用NEB的连接酶，一般连接RT放一个小时
6.酶切时间不要太长，1-3小时+0.5-1小时载体去磷酸化
7.不要太相信酶切鉴定，我有一个载体，重做了2次，每次酶切位点都突变，可以连进
去，但是切不出来了，建议lz做PCR鉴定之后送测序。 |
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x******o
发帖数: 76 | 25 想把6kb片段连进8.5kb的lentiviral vector里，试了几次都不成功，求助一下。
我是这么做的，单酶切得到6kb insert，切胶纯化，载体单酶切，去磷酸化，切胶纯化
。1:1比例4度连接过夜，转化stbl3感受态42度45秒，recover 1小时涂版，30度过夜，
板子上长几十个斑。挑斑入LB+amp 30度摇过夜，miniprep，酶切鉴定。跑胶时，总是
得到大概2kb的片段，无论是否酶切过。拿最近的一次质粒直接跑胶结果来看，12个克
隆，9个是2kb band，2个是degraded DNA（1-2kb size），1个是5kb左右（经酶切鉴定
可能是contamination）。 现在基本怀疑是LTR重组导致片段丢失，觉得自己已经考虑
了很多可能导致LTR重组的因素，所以只能问问大伙有什么建议。 |
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x******o
发帖数: 76 | 28 做短片段（1-2kb）的没太大问题，2kb的情况出现几率比较小，偶尔会有，没太留意。
对照板是指vector only吗？只有几个斑，没有挑过。
我以前dh5a和stbl3都用过，做短的没问题，最近做长insert总是做不出来。也许试试
换个batch感受态? |
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w******y
发帖数: 6 | 29 从酵母里提的质粒一般量比较低，所以要用高效率的感受态细胞，用top10转效果比较
好。 |
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m*******n
发帖数: 387 | 30 请问2万质粒的library，怎么转化扩增？
普通的感受态转化方法效率好低啊 |
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j****n
发帖数: 3370 | 31 两万？最普通的感受态也有10（6）效率吧。。。
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7 |
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s******y
发帖数: 28562 | 32 他现在是一个量子态，你在联系他之前根本无法确定他在哪里。 |
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s******y
发帖数: 17729 | 33 你看弦乐还来发表对生命科学的热爱了吗，她已经被我从热爱状态洗成感受态了 |
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b*****s
发帖数: 169 | 34 1.酶切后需要胶纯化再做连接
2.Q5之后要用PcR产物纯化kit纯化后再用Taq加A
3. T载体是pGEMT吧，有蓝色克隆吗？没有的话就是你的载体或是感受态细胞有问题，
或是抗生素用错了。
你的PCR有你想要的条带，一般不会是引物设计的问题了。
另外建议用0.5ul T 载体，10xligase buffer，加ligase，然后加的PcR胶纯化产物至
最终体积，4度过夜
祝好运！ |
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e****s
发帖数: 1125 | 37 要有液氮罐的话，放液氮罐吧。我也没有-80C。全仍液氮里了。大点的罐子不要加太多
液氮。很多样品不要直接泡在液氮里，似乎就问题不大。 |
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j****n
发帖数: 3370 | 38 不要忘了定期添加液氮
之前我们系一教授 学生半年没添液氮
然后细胞全死光了
他只能去个小学校当系主任养老了
现在我们系对液氮管的特严 hh
还专门买了个公用的-80冰箱 |
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m******o
发帖数: 8504 | 39 现在不是每个实验室都有-80吗？
楼主忽悠你们老板买个呀 |
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n**********g
发帖数: 196 | 40 哈哈，说个搞笑的，我们的感受态细胞一直我们自己做，一直很好。但是2010年前配的
buffer管用，从此之后的buffer一直不在work，新买了各种Sigma试剂，最终结果依然
是old buffer可以，新的一直不可以。2013年用完最后一滴old buffer后，改用公司的
kit，到现在都不知道不work的原因，我只好把他归结为旧的buffer用完了，哈哈
buffer |
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U******u
发帖数: 5829 | 41 人生没有过不去的坎儿（之二）
力刀
人生，你会遇到不少坎儿、沟、绝壁。
有时，真的很难、很难、很难！甚至是到了绝路……
这两天国内外都在传播轰动纽约的纽约西奈山医学院前中国科研助理教授枪击校长同事
案件。看到那个报道，和最近美国几个医学专业协会关于乳腺原位癌（DCIS）的指南，
感慨万千！
老刀五年前在加拿大的一个病例，无非就是把DCIS按ADH叫（因为病人做过活检，创腔
周围残余几个atypical acinars, 我按照炎症反应重的环境，step back, not over
call 原则，就call了ADH，而且切缘阴性，2毫米以上！就这被认为“误诊“，被上报
、上电视台，成了“世界名人、名医”，经历了我这人生最黑暗的加拿大版“缝肛门”
事件，至今，在国内甚至美国的中国医生圈里还有一些同行人在不遗余力地“揭开美国
病理医生何刚的画皮“，公开捅刀子的！
当时，这个病例出现争议时，我提出：是我的病例，我有权送我希望的第三方会诊，也
就是second opinion,我提出送哈佛或康奈尔最著名的两位乳腺病理顶级专家，单位不
干，送到美国一个商业病理公司实验室，可会诊结果又竟然不告知... 阅读全帖 |
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s***e
发帖数: 7166 | 42 副教授都不给，你也回去？未免可惜了人才啊。
地方探险一样
像是个外人。
说，
态一直下去并不利于事业发展。 |
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g*****i
发帖数: 1236 | 43 说得挺不错!
赞!
地方探险一样
像是个外人。
说，
态一直下去并不利于事业发展。 |
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x******i
发帖数: 3022 | 44 这个所谓的"外人"心态很常见,属于"culture shock"的一种阶段.
地方探险一样
像是个外人。
说，
态一直下去并不利于事业发展。 |
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m***l
发帖数: 267 | 45 super zan
地方探险一样
像是个外人。
说，
态一直下去并不利于事业发展。 |
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g****t
发帖数: 31659 | 46 《三体III：死神永生》
作者：刘慈欣
申明:本书由奇书网(Www.Qisuu.Com)自网络收集整理制作,仅供预览交流学习使用,版权归原作者和出版社所有,如果喜欢,请支持订阅购买正版.
写在"基石"之前
姚海军
"基石"是个平实的词，不够"炫"，却能够准确传达我们对构建中的中国科幻繁华巨厦的情感与信心，因此，我们用它来作为这套原创丛书的名字。
最近十年，是科幻创作飞速发展的十年。王晋康、刘慈欣、何宏伟、韩松等一大批科幻作家发表了大量深受读者喜爱、极具开拓与探索价值的科幻佳作。科幻文学的龙头期刊更是从一本传统的《科幻世界》，发展壮大成为涵盖各个读者层的系列刊物。与此同时，科幻文学的市场环境也有了改善，省会级城市的大型书店里终于有了属于科幻的领地。
仍然有人经常问及中国科幻与美国科幻的差距，但现在的答案已与十年前不同。
在很多作品上(它们不再是那种毫无文学技巧与色彩、想象力拘谨的幼稚故事)，这种比较已经变成了人家的牛排之于我们的牛肉。差距是明显的--更准确地说，应该是"差别"--却已经无法再为它们排个名次。口味问题有了实际意义，这正是我们的科幻走向成熟的标志。
与美国科幻的差距，实际上是... 阅读全帖 |
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c****t
发帖数: 19049 | 47 ☆─────────────────────────────────────☆
casact (尝尝也) 于 (Tue Jul 5 01:17:00 2011, 美东) 提到:
第一章 被驱逐的高手
更新时间 2011-2-28 15:15:57 字数：4023
“卡卡卡，嗒嗒……”
一双灵巧的手飞舞着操纵着键盘和鼠标，富有节奏的敲击声仿佛是一首轻快的乐
章。屏幕上漫天的光华闪过，对手飞扬着血花倒了下去。
“呵呵。”叶秋笑了笑，抬手取下了衔在嘴角的烟头。银白的烟灰已经结成了长
长一串，但在叶秋挥舞着鼠标敲打着键盘施展操作的过程中却没有被震落分毫。摘下的
烟头很快被掐灭在了桌上的一个形状古怪的烟灰缸里，叶秋的手飞快地回到了键盘，正
准备对对手说点什么，房门却突得咣一声被人打开了。
叶秋没有回头，像是早就在等着这一刻一样，只是问了一句：“来了？”
“来了。”苏沐橙的回答也同样简单。
“那就走吧！”叶秋拒绝了对手又一次的邀战，轻轻地从网游荣耀专用的登录器
上摘下了一张卡片，起身来到门旁衣架顺手取下了外套。
夜已... 阅读全帖 |
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y****w
发帖数: 39 | 48 六、心是物质吗？
(1）智能机器人之争
“外面的物质世界，是虚幻的，并不存在，离一多故。”
“喂，你到底想说什么啊？！”
“我是说，外境是心的幻象，如梦一般。”
“敢情，你用了这么长一节，绕了一个大圈，就是为了得出前面提到的那句话。‘那个
当年的孩子’怎么说来着？对了，物质世界，还有一个名字，叫做‘梦’。”
“是的。物质如梦。外境如梦。色法如梦。在梦里，我们可以梦见自己开着‘宝马’和
心爱的女友兜风，就像白天一样真实。但是我们知道，正在做梦的当下，在做梦的房间
里根本没有一辆宝马汽车。所有的一切，都是自己梦心里的幻现。”
“外境是心的幻现。可是，心是什么呢？”
“心就是心。”
“可是，我们从小学到的科学知识，心不是物质产生的么？”
“知识是一回事，真理是另外一回事。智者应该追求真理，而不是知识。”
从整个历史来看，持唯物主义观点的人，一直是少数。但是就我们这一代人所学到的知
识来看，唯物主义确实深入人心。
虽然，量子力学的发展，几乎剥夺了传统唯物主义和传统唯心主义生存的土壤。但是，
随着智能机器人的发展，和认知心理学的发展，在某个范围内，人们的唯物主义观念，
还是非常深厚。所以，刚才的... 阅读全帖 |
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y****w
发帖数: 39 | 49 六、心是物质吗？
(1）智能机器人之争
“外面的物质世界，是虚幻的，并不存在，离一多故。”
“喂，你到底想说什么啊？！”
“我是说，外境是心的幻象，如梦一般。”
“敢情，你用了这么长一节，绕了一个大圈，就是为了得出前面提到的那句话。‘那个
当年的孩子’怎么说来着？对了，物质世界，还有一个名字，叫做‘梦’。”
“是的。物质如梦。外境如梦。色法如梦。在梦里，我们可以梦见自己开着‘宝马’和
心爱的女友兜风，就像白天一样真实。但是我们知道，正在做梦的当下，在做梦的房间
里根本没有一辆宝马汽车。所有的一切，都是自己梦心里的幻现。”
“外境是心的幻现。可是，心是什么呢？”
“心就是心。”
“可是，我们从小学到的科学知识，心不是物质产生的么？”
“知识是一回事，真理是另外一回事。智者应该追求真理，而不是知识。”
从整个历史来看，持唯物主义观点的人，一直是少数。但是就我们这一代人所学到的知
识来看，唯物主义确实深入人心。
虽然，量子力学的发展，几乎剥夺了传统唯物主义和传统唯心主义生存的土壤。但是，
随着智能机器人的发展，和认知心理学的发展，在某个范围内，人们的唯物主义观念，
还是非常深厚。所以，刚才的... 阅读全帖 |
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c****t
发帖数: 19049 | 50 ☆─────────────────────────────────────☆
casact (尝尝也) 于 (Fri Jul 22 20:55:29 2011, 美东) 提到:
刘慈欣
《三体》终于能与科幻朋友们见面了，用连载的方式事先谁都没有想到，也是无奈之举
。之前就
题材问题与编辑们仔细商讨过，感觉没有什么问题，但没想到今年是文革三十周年这事
儿，单行
本一时出不了，也只能这样了。
其实这本书不是文革题材的，文革内容在其中只占不到十分之一，但却是一个漂荡在故
事中挥之
不去的精神幽灵。
本书虽不是《球状闪电》的续集，但可以看做那个故事所发生的世界在其后的延续，那
个物理学
家在故事中出现但已不重要，其他的人则永远消失了，林云真的死了，虽然我有时在想
，如果她
活下来，最后是不是这个主人公的样子？
这是一个暂名为《地球往事》的系列的第一部，可以看做一个更长的故事的开始。
这是一个关于背叛的故事，也是一个生存与死亡的故事，有时候，比起生存还是死亡来
，忠诚与
背叛可能更是一个问题。
疯狂与偏执，最终将在人类文明的内部异化出怎样的力量？冷酷的星空将... 阅读全帖 |
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