O**********m
发帖数: 781 | 1 还有，你在中国所作的一切放在心里很难受吗？其他人没像您这样宣天下而告知并不代
表甚末也没做。拜托不要把别人单纯讲事实变成单方面一厢情愿的想象别人如何如何。
真正傲慢的是某些人，自以为中国天下第一，进步一丁点就成天下最大的成就，这种心
态大学时期就已经过了。 |
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e****c
发帖数: 840 | 2 你最近回去过没？回去体验一下
btw，描述一下我是啥心态？居然严重到要用可悲来形容？
我也不知道自己说国内空气差的时候啥心态，陈述事实而以
态...
意义。 |
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p*******0
发帖数: 153 | 3 好象这里的人都形成思维定式了....我到是觉得,也可能是因为她知道国人对待外F的态
度，所以
才会这样.如果她不知道国人讨厌这个，就无从用"挑衅"这个词了.逆反心理下的幻想,要是只觉得
是高人一等的光荣，幻想的别人的眼光应该是羡慕不是挑衅 |
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u**a
发帖数: 220 | 4 这次回国呆的时间比较长，一个半月左右。北京上海一线城市和重庆，苏州这些二线城
市都跑了。
人
人多，乌央乌央的人，尤其是北京，地铁高峰期咱就不说了，几次都是10点多了上
地铁人都跟相片似地，地铁工作人员最后都来帮忙把人往门里面塞。
吃
不多说了，基本上每天都在馆子里，往往装修很好的店菜品味道反而一般，都是朋友同
学老同事带着去他们认为比较好的馆子，往往能大饱口福，美食在民间一点不假，不过
在国内的男性同学朋友几乎都是脂肪肝和高胆固醇，这个是国内吃的爽的代价吧。
穿
国内的款式更符合亚洲人的体型，款式非常多，国内的女性非常会打扮，但穿的成本和
十几年前已经不可同日而语了。除非你只考虑野店和路边小摊，只要是进了稍微像样的
服装店，最好做好心理准备。 出国前在Outlet买的$80 CK的小风衣在重庆解放碑的大
都会卖到了￥2600,回国穿的一双Clarks的牛皮鞋($60)在解放碑的专卖店卖到￥1680，
这边$60 Levis牛仔裤国内卖到￥800，越是海外牌子货国内卖的越贵，所以当你羡慕国
内吃喝玩乐的时候，国内人正羡慕你全身上下都是世界名牌却花费不到$300的生活呢。
住
谈起中国，... 阅读全帖 |
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c******u
发帖数: 174 | 5 国内id认为 描写得很理性 也很真实
这次回国呆的时间比较长，一个半月左右。北京上海一线城市和重庆，苏州这些二线城
市都跑了。
人
人多，乌央乌央的人，尤其是北京，地铁高峰期咱就不说了，几次都是10点多了上
地铁人都跟相片似地，地铁工作人员最后都来帮忙把人往门里面塞。
吃
不多说了，基本上每天都在馆子里，往往装修很好的店菜品味道反而一般，都是朋友同
学老同事带着去他们认为比较好的馆子，往往能大饱口福，美食在民间一点不假，不过
在国内的男性同学朋友几乎都是脂肪肝和高胆固醇，这个是国内吃的爽的代价吧。
穿
国内的款式更符合亚洲人的体型，款式非常多，国内的女性非常会打扮，但穿的成本和
十几年前已经不可同日而语了。除非你只考虑野店和路边小摊，只要是进了稍微像样的
服装店，最好做好心理准备。 出国前在Outlet买的$80 CK的小风衣在重庆解放碑的大
都会卖到了￥2600,回国穿的一双Clarks的牛皮鞋($60)在解放碑的专卖店卖到￥1680，
这边$60 Levis牛仔裤国内卖到￥800，越是海外牌子货国内卖的越贵，所以当你羡慕国
内吃喝玩乐的时候，国内人正羡慕你全身上下都是世界名牌却花... 阅读全帖 |
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m**********e
发帖数: 2808 | 6 不過可能以當時嘅意識形态，推翻又如何?换過皇帝而己，可能所謂嘅励精圖治，换來
苟延残喘几十年，未必係好似日本噤勁，反而推遲陳痛的時問，反而到了孫中山時，宪
制思想普遍了，再走回頭路不容易了，那怕實行專制，始終要一层遮羞布，要在意識形
态上有群眾基础，這様，那怕再愚民，當信息封鎖不再容易時，民眾不会再自我思想画
地為牢，回頭路好難。
不要以爲平等思想容易得，現在這世界上還有不少國家是一直恶牲循譞看不到改良的希
望，中國再多各種風險，始終有enlightened population，甚至現在環境，出个
enlightened despot也可能，足够運氣的話，還是可以平安走下去。 |
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d***e
发帖数: 243 | 7 我来补充一下,不是查google的,是三年前在北医帮导师写教材时我的一些理解.
Transfect一般是指各种artificial的手段给动物细胞内导入外源的基因片段.
Transduction ,conjugation涉及的是细菌间的基因转移,不关真核细胞的事.
1. 转化(Transformation).受体菌直接摄取供体菌游离DNA片段,转化的DNA片段可以是细
菌溶解 释放,也可以是人工提取. 摄取能力称为感受态 competence.应用吗,可以讲是最
早证实了DNA是遗传物质的Griffith的肺炎球菌实验.
2.转导 (Transduction). 温和噬菌体介导的遗传物质从供体菌到受体菌的转移.这里强调
的是temperate phage, 不是指溶原性噬菌体lysogenic phage.作用是细菌自发获得一些
新的protein,eg. toxin or antigen.
3.接合(Conjugation). 是plasmids介导的细胞间接触,是供体菌遗传物质进入受体菌.供
体菌遗传物质不一定就非是供体菌的gene,也可能只是供体菌的质粒transfer到rece |
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p*****n
发帖数: 981 | 8 ☆─────────────────────────────────────☆
xydotcom (牛牛) 于 (Wed Dec 20 15:41:17 2006) 提到:
连接以后转化,长出克隆了.摇过夜以后发现细菌长的很慢.即使长出来了,也提不出DNA.
要说是污染,为什么一起作的control好的很,没有任何问题.
要说是连接失败,为什么还能在抗性板上长出来?
用的就是普通的DH5a,连接也就是800bp片断和12kb的载体.
哎,实在是没辙了.
☆─────────────────────────────────────☆
sca (新中美) 于 (Wed Dec 20 15:48:15 2006) 提到:
做个菌落PCR鉴定一下。
DNA.
☆─────────────────────────────────────☆
zhuti (zhuti) 于 (Wed Dec 20 16:00:14 2006) 提到:
重新做感受态,换个菌株
☆─────────────────────────────────────☆
xydotcom (牛牛 |
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x*****e
发帖数: 309 | 9 贴个我的做法吧，成功率很高，供参考。
1、引物退火溶液Annealing buffer: NaCl 100 mM, Hepes 50 mM, pH 7.4
(1ml: NaCl 2M 50ul, HEPES 1M 50ul, 加水至1 ml，pH试纸调pH)
2、引物浓度约=28.3ug/OD, 加入94ul Annealing Buffer 至终浓度 0.3 mg/ml
3、加入上下游引物各10 ul，Annealing Buffer 30 ul，90度4分钟，70度10分钟，然
后放到500 ml装有70度热水的烧杯中，室温冷却后连接或-20度保存。
4、连接质粒，加入2ul退火后的产物，1 ul T4 DNA ligase buffer, 1ul pSR/BglII+
HindIII 线性质粒, 5 ul 水，1 ul T4 Ligase. 连接（16度过夜或室温30－120分钟）。
5、加入1 ul Bgl II 至连接产物中，37度消化30分钟，转化感受态细胞。
6、挑取转换子，提质粒，酶切鉴定，注意阴性克隆切出条带大概1kb（227，248和
281bp条带差异不明显，故对 |
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h***e
发帖数: 146 | 13 >20kb的质粒是不是很难转进去啊？ 还有大家是怎么鉴定的？我每次都用酶切，不好判
断，因为本身都有农杆菌本身就自带质粒。谢谢 |
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x******8
发帖数: 350 | 14 thank you guys! I feel shameful about myself after reading your notes.:)
Anyway, how about the quality of plasmid? Is there some special requirement
for it? |
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x******8
发帖数: 350 | 15 And,
1. how about the difference between different isolates, e.g. LBA4404 or
GV3101 etc.?
2. Can I use the isolate that is grown on LB plate and put in 4 degrees for
2 weeks?
3. Do I need add some antibiotics, such as rafimycin or gentamycin for
GV3101 when I prepare overnight culture?
Thanks a lot. |
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x******8
发帖数: 350 | 16 让您见笑了。那我降低电压试试？
您可以具体指点下不？ |
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x******8
发帖数: 350 | 17 我的11k多，是否也是原因？找个小的试验下。
我觉得鉴定的话是否可以作pcr？ |
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h***e
发帖数: 146 | 18 小的很好转的 一般只要抗性有就OK，最好抗生素浓度调高点。PCR也可以的，但是只能
检测部分序列。不过我感觉还是酶切放心，但就是容易降解，带很难分辨。 |
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h***e
发帖数: 146 | 20 >20k的效率很低，长很多的克隆有可能不对
反正我转的都不怎么好 不好验证对不对 |
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R*****w
发帖数: 447 | 21 把别人的试剂（知道肯定行的）借过来，自己再做一次。用试剂盒出不来还真是怪事。
要不就是你的细菌有问题，换个质粒试一下。这种情况我也遇到过几次，有时同时提的
几个质粒有的有，有的啥都没有。重新转化其他感受态细胞，再提又有了。 |
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b******n
发帖数: 4225 | 22 怎么说呢，我觉得用买的也没错，只要有钱用得起就行
整天这儿算计那儿算计怎么省钱，省了钱就不省时间啊
自己做感受态还得盯着到点再去离心啥的，这些小事情积累多了时间就不明不白地花掉了
还不如看看文章多动脑筋想想怎么规划做实验更合算
就是聊天我也觉得比自己配培养基灭菌倒平板合算
聊天也能激发灵感呢
其实主要看有没有钱，没钱得省钱
有钱就得省时间了 |
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n***w
发帖数: 2405 | 23 嗯。。。说得很对呢。。
我去学学怎么做感受态细胞。。。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 24 不是，不过Invitrogen的MegaX DH10B是电转的感受态细胞
挺好用的 |
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r****r
发帖数: 379 | 25 一般大片段克隆，会导致连接效率很低，克隆数大大减少，可以看看你的克隆数和你常做的克隆比是不是还比较正常，如果比较正常，那说明这种假阳性很可能是因为你的插入片段有一段序列比较容易发生重组，试着30度长克隆和摇菌看看。另外，能不用单酶切做克隆就不要用，你大片段克隆还用这个策略，最好换其它双酶切。
另外，单就大片段克隆而言，建议用GeneHogs菌株，我手上的片段普遍10k以上，用这个菌株，从来没出现过问题，感受态效率一般7次方就可以了，15kb可以长百来个克隆。
因此建议先更换单酶切策略和换genehogs，然后不行再换30度生长看。30度生长，已发生重组的质粒，一般10个有2个总是对的。
gone
cut |
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b******n
发帖数: 4225 | 26 我用PFU做过接近10k的质粒的点突变
取决于引物的设计和高效率的感受态
13k应该也可以吧 |
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a****o
发帖数: 1786 | 27 产物可能有毒性
可以用特殊的感受态细胞
可以加到一个由逆向启动子的载体里
这些都可以试，
但不保证会解决问题 |
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s******s
发帖数: 13035 | 28 有抗生素的都无所谓啦，最多做感受态的时候要点灯，从来没在hood里做过e.coli |
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W*****o
发帖数: 1780 | 29 俩都作生物挺好的。她怀孕时，我帮她做实验；平时她缺啥了，一个电话我给送去或者
直接帮忙做了。什么平板，酶，感受态....都share.有什么讲座一起去听，一起吃
pizza,一起出去开会，过qualify前我帮她练，她帮我练。申请什么fellowship,travel
award我抄她的，她抄我的；学什么新技术仪器俩人一起去报名一起学；问公司要t-
shirt要两件她要小号，我要大号一起穿出去就情侣装。上课作业互相讨论。每天一起
散步上学，一起放学。天热一起去实验室避暑。 |
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c*******y
发帖数: 161 | 30 我电转过DNA片段到大肠杆菌细胞,用的是Bio-Rad的仪器,只是设定电压2.5KB,其他条件
不用设置,效果很好.还有制备好的电转感受态细胞很重要的.我的意见仅供参考. |
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T**********t
发帖数: 1604 | 31 Stratagene的QuikChange Kit，我所有的mutants都是用这个kit做的。
Stratagene现在改名叫Agilent Genomics了。
自己PCR也行啊，用kit主要是方便，所有需要的东西都给你配好了，多省事。要不然你
不是还得另外买限制酶和感受态细胞么。 |
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H****s
发帖数: 301 | 32 有两个建议：
（1）改双酶切连接为单酶切连接。载体要处理好。
（2）使用DH10B感受态。或者是类似的RecA-菌。
我做的插11kb到5kb的载体上去，基本上都成了。 |
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b*******6
发帖数: 39 | 33 具体步骤基本是这样的：
1 PCR 50-100 ul体系，所得产物跑胶后回收，所有产物均酶切（大概5ug，可能很多，
但是太少了最后会看不到；Fastdigest推荐protocol是切200ng 1ul酶，10min；所以开
始的时候切3个小时，因为当初质粒3个小时能切下来；后来过夜切，出现2个条带；PCR
产物比比质粒难切）；质粒一般切4ug，3个小时（BamH1切1小时，Hind31小时，碱性磷
酸酶1小时），或者在Bamh1灭活之后Hind3过夜切（BamH1据说明书超过1小时就有星号
活性）；酶切体系50ul，Fastdigest酶各1ul。所有酶切产物切胶回收，nanodrop定量。
2 连接50ng质粒，50ng片段（大小比是5：1，所以数量比大概是1：5），10ul体系，室
温1小时或者4度过夜。
3 转化：5ul产物加入到50-100ul感受态，冰浴30min，42度热激90s，冰浴2min，加入
800ul LB，37度30-45min，3500rpm 3min 离心，留100-200ul混匀细菌涂板。 |
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A**********0
发帖数: 6942 | 34 你的做法：连接50ng质粒，50ng片段（大小比是5：1，所以数量比大概是1：5），
10ul体系，室温1小时或者4度过夜。 转化：5ul产物加入到50-100ul感受态
我觉着太保守了。。。 不过，好多人都是这么一直做的。
你试试不要定量定的那么仔细，大概用500ng片段和100ng质粒做连接，
然后体系变成20ul做一次试试看。。。
PCR
量。 |
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h**********r
发帖数: 671 | 35 不知道版上有没有同修用BioBrick？例如NEB的http://www.neb.com/nebecomm/products/productE0546.asp或iGEM的。我以前没有接触过。最近要从别的实验室要到一个质粒，带有BioBrick。我有几个疑问：
1. 扩增克隆质粒是不是必须用E. coli DB3.1?
BioBrick上带有ccdB。ccdB is a lethal gene that targets DNA gyrase。E. coli
DB3.1上有gyrA462的突变。可是JM109，DH5a还有XL1-Blue上有gyrA96的突变。实验室
没有DB3.1，但有JM109。不知道可以替代不？Invitrogen有新一代的One Shot®
ccdB Survival 2 T1R Competent Cells出来。可是贵啊，没有买感受态细胞的
习惯。
2. 虽然ccdB是个negative selection marker,感觉不像sacB那样有用,在biobrick里面
有点多此一举吧。还是我的理解不够深入？
http://partsregistry.... 阅读全帖 |
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b**********8
发帖数: 349 | 36 如题，手上的一个真和表达质粒，据说是当初从Addgene买回来的，DH5alpha的菌液，
前段时间快用完了，用TOP10做了转化，使用invitrogen的midi prep kit提取中抽，产
量超低，几乎看不到沉淀，重复两次都一样，同一批操作的其它质粒都没问题，产量一
般在100ug左右。后来考虑是不是感受态不同导致，找别的组要了DH5alpha回来转化，
再提，还是没有改善，只能看到很少的一点点白色沉淀，现在正在airdry，估计产量也
就在几ug的水平，请问大家有没有遇到这个问题，该怎么解决呢？ |
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T**********t
发帖数: 1604 | 37 我原来在版上发过帖子问过的：
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31400349.html
你看看和你的culture长得像不像。
实验室表达蛋白用的大肠杆菌菌株都不是野生型的，通过基因改造改良了很多性状。其
中不少是通过噬菌体转染的手段整合到大肠杆菌基因组的。比方说名字含有DE3的菌株
，就是溶源性整合了λ-DE3噬菌体，用于表达T7 RNA polymerase。溶源性噬菌体一般
不会裂解，而是随宿主细胞一起复制。但是极少数情况下会产生自发裂解或者诱发裂解
。我上次碰到的情况是和培养箱温度有关，有可能是培养箱温度过高诱发了噬菌体裂解
，但是其他的一些极端条件也可能会是裂解的诱因。
大部分情况下溶源性噬菌体被诱发裂解是因为宿主细胞遇到了不利的生存条件，我觉得
在你的情况下，会不会有可能是因为minimal培养基营养不够？你试试改改培养基的配
方看？不过我上次在买了新的感受态细胞重新转化之后，对温度也不敏感了，所以也许
换一个新的strain也有用。 |
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s**e
发帖数: 1523 | 38 Tech有时候也磨洋工啊。我们实验室的小黑，做ligation的时候，切了载体，可是没切
PCR产物，然后做不出来说感受态细胞不好。要不是我一步步问下来就被他忽悠了。我
也很郁闷。而且我不像楼上的ibmgoog，还能tough得起来，我觉得我自己就挺面的。不
知道怎么对人凶，估计凶起来人家也能看出来我就是个纸老虎。小黑就是拖着活不干，
在老板面前说得非常辛苦，老板也拿他没辙。我成天都看不到他人，听他忽悠老板，都
替他脸红。可又不想去揭发-损人不利己，伤rp啊。 |
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r*****t
发帖数: 4793 | 39 连接后转化，有菌落长出，但是提不出质粒
我试了买的感受态细菌和自己做的电转的菌，都是一样的结果，有菌落，提不出质粒
提质粒用的是ｑｉａｇｅｎ的ｍｉｎｉｐｒｅｐ，应该没问题
摇的菌好像不太对，长的不够浓，离心下来只得到一点菌，而且看起来不太对劲，比较
＂粘＂，正常离下来的像一堆沙子，这个像粥
还有就是我的载体质粒比较大，有１４ｋ
到底怎么回事啊？愁死我了 |
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h*1
发帖数: 64 | 40 以前也遇到过类似的情况 ，总是看到菌也很厚重就是没有质粒
后来发现原因是葡萄球菌的感染， 楼主可以检测一下。看看是怎么回事。
要是你的感受态细胞就有问题，那么你后续的所有的实验都会有问题。 |
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E***u
发帖数: 60 | 41 直接取连接混合物转化涂版什么也没有
用感受态洗了一下连接混合物的管壁转出来满版都是 |
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y*********u
发帖数: 183 | 42 遇到过一模一样的情况
话说楼主应该也遇到过吧，要不然怎么突然就拿感受态洗管子了…… |
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b*******g
发帖数: 1040 | 45 我要纯化蛋白，构建了GST表达载体，要转化到rosetta 感受态菌中。现要知道我这个
蛋白是否需要bisulfide bond， 如果需要，就需要一种特殊的rosetta.
想请教有什么free的软件可以分析蛋白在包装过程中是否需要bisulfde bond呢？
本人对蛋白结果研究 一点不懂，也没纯化过蛋白。
大侠们的任何指点都感激不尽！ |
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b*******g
发帖数: 1040 | 46 能否详细说说？
我本来根本不知道啥是bisulfide, 昨天往公司打电话order rosetta感受态时,技术支
持说得知道我的蛋白是否需要bisulfide才能order, 如果order 不正确，纯化蛋白是会
很难，意思就是抗体拽不下来。
. |
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b*******g
发帖数: 1040 | 47 本人没做过蛋白纯化，对其一无所知。现以构建了GST表达质粒，要转化到rosetta 2
感受态细胞中，然后纯化蛋白，请大家推荐beads. 请告知详细信息，如公司，catalog
number.
本人菜鸟一个，望大家帮助！
谢谢！！！！！！ |
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