c********d
发帖数: 75 | 1 有个蛋白在细胞表达过程中降解很厉害，不同的条件下表达也不同。我能用ELISA来检
测该蛋白在不同条件下的相对表达总量吗？用的是anti-peptide antibody，标准曲线
只用一抗二抗。
我觉得是不太合适的。
1. 抗体不能检测到失去epitope的蛋白
2. 保留epitope的蛋白在不同大小蛋白上面向有利抗体结合的构象几率不一样
3. 不同蛋白降解产物的结合孔板的亲和性不一样。
我的理解正确吗？请大家指点！谢谢！ |
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s********r
发帖数: 312 | 2 neon的公司销售到我们实验室的时候，用一个他们的GFP reporter转ES，我显微镜下一
看果然全亮了。然后我问他们这个质粒多大，结果好像2k都不到。我就给他拿了一个我
做targeting的质粒17k，说你转我这个试试，一个6孔板就基本见不到亮的。。。他很
不好意思的走了，我也感觉有点对不住他。。。 |
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b*******0
发帖数: 125 | 3 弱弱的问个白痴问题，qPCR 加 Master Mix（除cDNA）时 有没有必要换枪头呢？
我们做的是384孔板。买的是排枪，枪头价格不菲。加cDNA 肯定是换枪头的。但是加 Master Mix有没有必要换呢？有经验的讲讲 |
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p********i
发帖数: 116 | 4 请问版上有人用96 孔板做过免疫荧光吗？用的是什么样的板子？另外这个可以加
mounting medium吗？然后怎么seal呢？谢谢。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 5 那个啥，目的就是要挑抗性克隆么？不能直接dilute在96孔板么？为啥还要P1/P2/P3?
1 |
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j**k
发帖数: 43 | 6 请问一下，ES细胞用 1X HAT筛选7天以后，可以看见一些克隆，但是把克隆pick下来，
转到96孔板以后，就不长了。有人遇见过这个问题吗？多谢了！ |
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n***w
发帖数: 2405 | 7 实验室人都走了。
神通广大的生物医学版，
96孔板做RT, 一排是4个样本，1个共同基因。
这些样本最后都有threshold cycle，但是两个样本没有melting curve （none）。
这到底是为啥呢？
肯定不是cdna的问题，因为其他的primers都work的不错。
觉得也不是primer的问题，因为其他样本有melting curve (偏偏就是我的KO没有。。
。。)
google了一下没找到符合的说法，基本都是有melting curve，没有amplification。。
。。
我是不是应该跑胶check一下。。
谢谢。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 8 good to know
虽然我暂时用不到，不过这个trick听上去不错 |
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b*******0
发帖数: 125 | 9 多谢楼上的几位达人 相助。
to2楼，
我用24孔板做，只能看到几个零星的绿点（GFP），
to4楼，
我要转的基因片段达8KB，有什么好用的病毒载体推荐吗？
多谢啦！ |
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i***0
发帖数: 160 | 10 Flexstation3，萤光，自发萤光，吸光，偏振萤光都可测，前两个表现非常稳定。可测
6-384孔板。我们组才买入，很不错。 |
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i***0
发帖数: 160 | 11 Flexstation3，萤光，自发萤光，吸光，偏振萤光都可测，前两个表现非常稳定。可测
6-384孔板。我们组才买入，很不错。 |
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t*****3
发帖数: 878 | 12 【 以下文字转载自 Dreamer 讨论区 】
发信人: Dreamer (不要问我从哪里来), 信区: Dreamer
标 题: 求助！实在是走投无路了！
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Dec 28 04:35:31 2012, 美东)
本人千老一名。最近实在是被折腾的走投无路了，想借助大家的思路，看看我这个情况
怎么办。最近几个月的实验总是出问题。我培养的细胞前一段时间总是被污染，好了一
段时间后最近开始大批的死亡，而且死得很怪异。比如一盘24孔板的细胞，有的死有的
长得很好。要是说是技术问题的话，一样的细胞一样的培养液怎么会有的死掉有的好好
的，还有就是基本上比较耗时间的实验的细胞全死光了，而且就是在关键的时间点上。
最主要的是细胞大批连续发生2次了，我和我们实验室的technichian们还有几个要好的
薄厚们讨论了一下都觉得不可能是我的实验技术有问题。我们一致怀疑是有人搞破坏，
因为不光是细胞大批死亡，还有就是westernblot也被人搞破坏，具体就不说明怎么被
破坏的了。我们怀疑的那个人是去年刚招的薄厚，是个中国人。他刚来实验室的时候我
帮了他不少，还把自己的... 阅读全帖 |
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g*********s
发帖数: 350 | 13 用Parafilm包扎瓶口，或横向绕圈24孔板，然后几号笔划线跨过Parafilm.记得给我一
点专利使用费啊， 包子 |
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s*********t
发帖数: 464 | 14 有些实验重复不出来也不是因为有什么高深的trick。
我的一个实验原来至少3遍相同结果，后来停了几个月，上个月重新做发现趋势相同，
但有点差别，结果是因为换了另一个公司的6孔板，换回来就好了。象这些个不是trick
的细节，文章都不可能提的。 |
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w******y
发帖数: 2504 | 17 片子为什么不放在24孔板里染呢？我没有试过这个EXTRACTION BUFFER，不知道是干嘛
用的。一抗一般就是1:1000-- 1:5000吧。实在不行弄个阳性对照的看看。 |
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a******n
发帖数: 392 | 18 老鼠干细胞可以trypsinize后中和，然后直接加20％DMSO。可是人干细胞不能
trypsinize啊？ |
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i*********0
发帖数: 915 | 19 为什么人的不可以，你做EB assay的时候或者其他的diff assay的时候，就不要单细胞
悬液了么？我做的是小鼠的胚胎干。但是我觉得你可以用小鼠干细胞冷冻的方法，冻人
的干细胞。不过我我们是用20%的Freezing medium。 其实就是20% DMSO, 20% SERUM,
60% DMEM.
LZ可以小规模试试看，然后告诉大家结果呀。 |
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a******n
发帖数: 392 | 20 因为人胚胎干细胞解离成单细胞后会分化或者死亡，所以一般细胞传代时是不用
trypsin的。这时人和鼠干细胞不同的地方。 |
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i*********0
发帖数: 915 | 21 我明天问问我们实验室做过人的ips的，看他怎么说。 |
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m*****z
发帖数: 1451 | 22 可以单细胞，recover的时候加rock inhibitor就行了。 |
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a******n
发帖数: 392 | 23 多谢热心帮忙，等你的回音。
★ 发自iPhone App: ChineseWeb - 中文网站浏览器 |
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a******n
发帖数: 392 | 24 有经验的来了！复活的程序是怎么样的？要离心吗？
★ 发自iPhone App: ChineseWeb - 中文网站浏览器 |
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a******n
发帖数: 392 | 25 dispase之后什么步骤，直接加freezing media吗？不需要洗去或中和dispase? |
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m*****j
发帖数: 144 | 26 最近constructed了一个reporter strain tagged with GFP for screening drug, 可
试了实验室能用的所有media（LB10,YP, 3M+glucose），发现每种培养基都有很强
fluorescent background(就是说，在不加入reporter bacterium的情况下，信号度数
就很大了)。我想请教下大家，我还能尝试哪些media呢，有啥建议没？单纯的PBS确实
没有背景干扰，但是细菌没法在这里面长啊，我要不要试试PBS+glucose？
如果这个screening方法不能用（我们用96孔板筛选），我们就得一个个的fraction单
独做实验了，那工作量就是指数上升了
先谢谢大家了 |
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c*****i
发帖数: 1392 | 28 与细胞大小形态有关，我以前用的两种细胞大概需要4x10e4/well，在96孔板。自己做
个dilution看看最好。 |
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h*******o
发帖数: 4884 | 29 不会， adult NSC培养的前一个礼拜neurosphere 很少的
你看到的大部分片状的东西不是细胞，应该是debris， 等到能看到neurophere的时候
要通过离心来除掉debris
我们都是养在flask里面，长出大量neurosphere以后在dissociate，然后进行下一步试
验的， 那种直接养96孔板， 离心去debris 貌似比较麻烦 |
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m***u
发帖数: 39 | 30 在做一个transformation的实验，MCF10A细胞virus感染某个基因后puro screen 2天，
然后split到6孔板中。两三天后发现某些focus出现，但是不是很sure。有没有做过的
同行，说说你的意见? |
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m*******e
发帖数: 90 | 31 我直接用loading buffer加到六孔板里,然后煮样,上20ug左右的蛋白,跑最普通的胶,
HH3的条带非常亮啊,用的是cell signaling的抗体. 感觉这个蛋白丰度很高. |
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B*D
发帖数: 5016 | 32 从北朝转的
http://www.cctvdream.com.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=51
ge%3D1
注：由于之前实验室有同事认为本文对之前实验室的研究细节有泄密嫌疑，因此文章做
了删节处理。当然，公开发表的文献懂行的读者能猜出这些此处已删除的背面都是什么
，就请大家给个面子，不要人肉了。前面一段主要是让大家直观了解一下现代尖端生物
研究中上下游的长度，QA，QC的复杂性和研发技术平台的长期性。花十年，2-3代博士生
打造世界一流技术平台的艰辛，真的很不容易。这也从一个侧面阐述了“引进即落后，
追也追不上”的怪圈的产生原因，并通过一个例子来讲述怎样打破怪圈，建立世界一流
技术平台。
小议生物学研究中的技术平台的作用
上个月，我以前的实验室（后文为了描述方便，称为北大实验室）发表了一篇Cell的封
面文章，这是一个非常难得的成果。关系挺铁的哥们发了好文章，让人激动不已。关于
这篇文章的科学意义，Cell有专文评述，网上也有很多文章讨论，这里就不多谈了。笔
者特别欣慰的是，这篇文章标志着北大实验室相关技术平台达到世界一流水平。这个技
术平... 阅读全帖 |
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I***a
发帖数: 13467 | 33 多谢，
我没有讲清楚，转的是质粒，p siRNA，
方法就是，前一天把细包转到12 ／96 孔板上，第二天混合 DNA脂质体加到细胞里一段
时间，24-48小时检测
没有比较过，还不太清楚这两种方法。 |
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l*****g
发帖数: 43 | 34 和传统的夹心ELISA比，可以省去抗原纯化这一步。想降低成本，而且自己对蛋白纯化
不熟悉。本来以为自己是异想天开，今天发现公司有这种试剂盒卖。
自己做成表达抗原的细胞株，目的是检测抗体。在文章里看见同一个蛋白抗原，用表达
该蛋白的细胞可以检查到相应抗体，但和蛋白纯化后做成的ELISA试剂盒的结果没有详
细的比较。
细胞固定后在96孔板里不知道可以稳定保留多长时间？如果在本地用没问题， 运输会
不会带来蛋白性质的变化？
多谢大家！ |
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i*****e
发帖数: 633 | 35 前几天发帖问了个老鼠脑子的事儿，得到hellozero的热心解答。虽然我的皮质细胞还
是一塌糊涂，但是整个过程挺好笑的。把这个小故事写下来献给hellozero，谢谢你 :-)
**********************
本周周二是个值得纪念的日子。第一次操刀切了鼠脑，然后颤抖着去分离海马和皮质。
那一丁点儿脑组织漂在hibernate medium里让我想到了味增汤里漂的嫩豆腐碎片。正值
临近午饭时分，我不争气的咽了下口水。一旦肚子饿了，那么看什么都像食物，也想和
别人讨论食物。我问旁边在分离同一只老鼠的DRG的美国同事，美国人吃不吃动物的脑
子。她大吃一惊，咧了下嘴，然后摇了摇头。我试图和她解释我们中国人“吃啥补啥”
的传统文化精髓，但是她一副不太愿意听的样子。算了算了，我也就吃过一次火锅里的
猪脑，说心里话那并不好吃，从此再没吃过。打消了吃脑子的想法，我开始专心试图按
照hellozero的指示来做实验。
我觉得自己平时做事儿还是挺麻利的，可是在hood用两把不锈钢超尖镊子翻动那丁点儿
大的脑组织，还要做剥离软脑膜，分离血管，切割碎块等等动作，就好象一个单身汉在
摆弄一个刚刚出... 阅读全帖 |
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s******s
发帖数: 13035 | 36 要么试试不要磷酸化，直接多加5倍insertion连，然后用96孔板pcr检测insertion |
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a******a
发帖数: 283 | 37 有个问题需要大牛的智慧。
两个病毒载体，一个是商业卖的做浓度标准曲线（用A序列的primers来测定）；一个是
自己构建的。主要骨架一样，只是我们自己做的除了有A序列之外，还有自己的靶基因B
序列。因此自己构建的载体，除了可以用A序列的primers之外，还可以用B序列的
primers来测浓度。
唯一的问题就是，B序列的测定因为GC成分高，所以primers反应浓度要高于A序列
primers的浓度。
作出来的标准曲线（同一个96孔板），用B序列的primers做的，Ct values要比用A序列
的primers迟上5-6个Ct。作出来的曲线，efficiency （都在90%-100%之间）和R
square（都在0.99以上）都类似。
但是作出来的EQUATION在Y-axis上的截距就不一样，差了有6的样子。这样用B作出来
的equation计算出来的样品浓度就比用A作出来的equation计算出来的样品浓度要高10
倍。
有什么看法吗？
这个B序列的primers反应浓度已经高得太离奇了，2um final concentration，低了就
更加出不了什么好的标准曲线了。... 阅读全帖 |
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s******s
发帖数: 13035 | 38 不知道这个东西。不过听上去，只要ips效率够高，不就是
经典的纱布印图章实验么。sort 10个384孔板单克隆，
长壮了，一分为三，一盘留种，两盘诱导。。。
） |
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s******s
发帖数: 13035 | 39 非也非也。你说的是colony pcr，这个我也经常在96孔板里做。
我说的是更加lazy的，连PCR步骤都没有，直接煮过就走胶，哈哈 |
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c********n
发帖数: 225 | 40 谈谈和蛋白打交道的日子 （七）
引子
光是个奇妙的东西。关于它的来源，各种族的传说都有异曲同工之处 - 中国有盘古开
天辟地带来光明； 圣经创世纪里有很权威的 And God said, Let there be light:
and there was light. 希腊神话普罗米修斯盗火给人类黑暗中带来光明，而自己却被
锁在高加索山的悬崖绝壁上，无怨无悔，忍受着宙斯的惩罚。
这篇咱们来散漫地谈一下生命之光吧， 只是一些体会，不严谨处见谅。
第七篇 生命之光
1.GFP
从一个“天才”对他学生们的challenge开始吧。 - “Tell me， why is GFP so
important to Biology？”
“天才”是他PhD老板在别人面前对他的赞誉。他每天的工作时间在14-16个小时，勤奋
带来的是各种荣誉以及源源不断的基金，即使在grant最黑暗的年代里，他的lab人员也
可以随心所欲的尝试各种方法。他的代价是一个人曲高和寡的寂寞， 在他娴熟悠扬的
小提琴声里慢慢的扩散，扩散。
回到问答， 年代flash back to GFP刚刚投入应用的时候。大家七嘴八舌，它是绿... 阅读全帖 |
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x********e
发帖数: 35261 | 42 直接做genomic PCR啊
如果是random mutation的话我知道有人用realtime pcr去screen TALEN mutant
如果是有target的话，比如CRISPR，我身边也有人直接设计target site的primer，然后
普通pcr就筛出来了
听听其他有经验的同学怎么说 |
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s*****g
发帖数: 87 | 43 可以用digital PCR,参见下文。
Isolation of single-base genome-edited human iPS cells without antibiotic
selection
Yuichiro Miyaoka, Amanda H Chan, Luke M Judge, Jennie Yoo, Miller Huang,
Trieu D Nguyen, Paweena P Lizarraga, Po-Lin So & Bruce R Conklin
Nature Methods 11, 291–293 (2014) doi:10.1038/nmeth.2840 |
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C*********h
发帖数: 83 | 45 在点突变位点做同义突变。
然后可以设计合适的引物做PCR。
只有KI进去之后才能PCR出来。
可以批量做。
detection, |
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V******t
发帖数: 444 | 47 如果一个实验室配齐下列仪器 就是天堂了
miniprep质粒 Qiagen的cube 能自动提质粒
western： 自动洗膜换液机
qPCR： 96孔板自动加样机
细胞计数：细胞自动计数仪
co－IP：自动加抗体洗beads仪
除了分细胞传代好像还不能自动化吧？
电动连续加样枪 电动排枪
然后所有sds gel都买预制的， 养细菌的agar plate、LB， 各种running buffer都有
技术员配好
老鼠genotyping有技术员做
各种buffer都买商用的
省下来的时间喝咖啡灌水逛街，当个千老也不是那么难过的事情了吧 |
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V******t
发帖数: 444 | 48 做实验做到吐了…
加样4个384孔板后无力吐槽 逛街游泳的时间都被实验挤占了！ |
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t**********n
发帖数: 283 | 49 Many thanks.
As for the control, we have a paralled transfection with GFP plasmid, whose
expression is low while positive.
Renilla readouts are 2~4，evan using different amount of plasmid, which is
almost same as the blank(就是96孔板上啥也没有的wells).
Luciferase readouts are 8~12( expected as negative).
We just had another experiment: luciferase readouts ~60, expected as
positive while Renilla readouts 8~11.
Not sure whether I expressed myself clearly or not.
is
3
his
worry |
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