a*******e
发帖数: 245 | 1 昨天连续做了40个construct的切胶，晚上发现手臂红了，有点灼热感，不知道问题严
重不
要不要看医生
有点担心，谢谢 |
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s********n
发帖数: 2939 | 2 可以用sybrgreen和invitrogen的切胶台，不是用紫外的，用的是可见光。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 3 求教：
我在做一个做knock in mice用的大质粒（12k)
单酶切后是一条12k的线性化的带
但切胶回收后跑胶，12k的带变淡，却出现两条很浓的9k和6k的带。
实验室同学怀疑是star activity,但鉴于我跑的是切胶回收后产物，我怀疑是长质粒自
身缠绕形成的结构，跑得比较快
请教大家遇到过这种情况么？（再次强调酶切后跑胶只有一条带，6k和9k的带是胶回收
后跑胶时出现的） |
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h**********r
发帖数: 671 | 4 隔一孔或几个孔儿跑一个样，把胶挖成一竖条儿一竖条儿的，分别切胶回收。
回收时垫块儿小保鲜膜，用完后再撕块儿新的。又不伤板子，又不交叉污染。 |
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c****1
发帖数: 1095 | 5 我个人的经验：
1。 保护好眼睛，戴眼镜，最好能戴透明面罩（就是前面有一个玻璃挡板的，有点焊工
的味道）
2。 尽量减少暴露时间。切条带的时候，一最快的速度，在条带四周作简单标记（用刀
片划一下即可），然后，关掉紫外灯，慢慢切。
3。 基本的，手套和lab coat肯定不能少。如果可能的话，可以涂点防晒霜试试（我从
来没有试过）。
Good luck！！ |
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f**u
发帖数: 346 | 6 连接的时候试试看不要切胶回收载体，直接PCR回收
另外你可以用100ml或者更多的细菌做mini prep，
虽然按照protocol这么多体积应当作midi，
但是不用管它，把所有的裂解液都上到小柱子上再洗脱就是了，可以增加浓度。 |
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s********n
发帖数: 2939 | 7 试试Life Tech的Size Select，不用切胶，直接吸就得到 |
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s********n
发帖数: 2939 | 8 试试Life Tech的Size Select，不用切胶，直接吸就得到 |
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m*****z
发帖数: 1451 | 9 谁让你在紫外灯下切了。我一般做几个标记，大光圈短时间曝光照一下，拿出来对着照
片慢慢切。反复几次就ok了。长时间照射对你或者克隆的DNA都不好 |
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f*1
发帖数: 837 | 11 《乒乓世界》2000年第7期至第10期
直板反胶的主要打法与训练: 加强正手进攻、精雕细琢前三板、提高相持能力、实用战
术训练
吴敬平
（一）怎样加强正手进攻能力
直板反胶打法是我国的传统打法之一，在我国运动员中占有很大的比例。据统计，在近
几年的全国锦标赛中，直板反胶打法的运动员约占全体参赛运动员的21—26％。因此，
如何面对欧洲弧圈球的巨大冲击，不断探索和创新直板反胶打法的发展方向与训练就成
为国家队近年来训练与研究的重点之一。
经过这几年的不断努力，我国直板反胶打法的运动员如马林、闫森都在国际、国内比赛
中取得了很好的成绩，具备了与世界超一流选手抗衡的实力。但由于相持中的攻防转换
能力还没有取得根本性的改变，因而从整个打法上讲还没有取得决定性的突破，因此，
这也是我们今后训练中必须重点解决的课题。
直板反胶打法的特点是积极主动，先发制人。主要以正手的大范围跑动进攻给对方以致
命的打击。这种打法的发展方向应摆脱传统的左推右攻和单面拉的模式，而建立一种全
新的模式。
它主要包括几个方面：1、正手的大范围跑动进攻是主体技术，也是这种打法员基本的
能力。正手进攻的杀伤力尤为重要。2、反... 阅读全帖 |
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y******y
发帖数: 107 | 12 想要在一个plasmid A里面加上一个基因的ORF。首先把这个基因用PCR给扩增出来（PCR
两个末端带有特定酶切位点序列 Nhe I和Age I，通过引物加进去的），然后连到pGEM
－T plasmid里面，transform之后筛选。然后用Nhe I和Age I酶切，agarose gel 切胶
纯化这段基因片断。
把plasmid A也用Nhe I和Age I酶切，同样的agarose gel 切胶纯化。然后把切胶纯化
的目的基因和plasmid A连接，transform之后筛选。
1,第一次得到大约10个colony，测序之后发现全部是plasmid A的序列。
2，这次把plasmid A用Nhe I和Age I酶切之后用Shrimp alkaline phosphatase处理，
然后再作连接。这次得到5个colony，简单的酶切鉴定之后发现全部又是plasmid A的。
electro-competent没有问题，做了阳性对照。不知道哪里有什么问题，谢谢。 |
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x******o
发帖数: 76 | 13 想把6kb片段连进8.5kb的lentiviral vector里，试了几次都不成功，求助一下。
我是这么做的，单酶切得到6kb insert，切胶纯化，载体单酶切，去磷酸化，切胶纯化
。1:1比例4度连接过夜，转化stbl3感受态42度45秒，recover 1小时涂版，30度过夜，
板子上长几十个斑。挑斑入LB+amp 30度摇过夜，miniprep，酶切鉴定。跑胶时，总是
得到大概2kb的片段，无论是否酶切过。拿最近的一次质粒直接跑胶结果来看，12个克
隆，9个是2kb band，2个是degraded DNA（1-2kb size），1个是5kb左右（经酶切鉴定
可能是contamination）。 现在基本怀疑是LTR重组导致片段丢失，觉得自己已经考虑
了很多可能导致LTR重组的因素，所以只能问问大伙有什么建议。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 14 没做过酶切回收测序，因为除非特殊情况（比如长重复序列）基本上没有这个需要。但
是PCR产物回收测序算是routine这没有什么疑问吧。你们测序中心给出的解释，类比一
下，个人觉得很牵强。我专门打电话给测序公司的技术支持，人家说没有任何问题，而
且常用的qiagen等胶回收试剂盒的说明上也写得很清楚，回收后的片断可直接用于测序
反应（参考试剂盒说明或主业）。
1. 胶回收自然会影响得率，一般损失在50%以上，但是只要你能保证回收后测序模板的
浓度（一般而言20-30ng/ul足够了），就没有问题，这应该是不难办到的。大不了酶切
体系做大一点，质粒多用一点而已。
2. 胶回收过程中DNA的变性复性没有那么夸张，如果是单链DNA有可能形成不规则结构
，双链除非特殊情况，还是很稳定的，你的酶切产物和一般的PCR产物没有本质的不同
，测序上自然也没有明显的差异。建议你问问他们是不是PCR产物胶回收测序也不能做
，如果是这样的话，那就没什么可说的了，建议你送公司测序吧，你们的测序中心不靠
谱。
不知道你们那里是什么情况，反正我们这里的测序中心就是垃圾。硬件倒是很好，2台
454，2台GA，还有好几... 阅读全帖 |
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f*1
发帖数: 837 | 15 [转帖]专业选手讲长胶
我非常喜爱长胶打法，于是寒假回家拜访了在家乡享有盛名的长胶运动员张学勤
老师，几次的谈话我对长胶有了更深的了解，于是写下来和各位分享。
先介绍一下这位选手，他是国家一级运动员，一级裁判员，一级教练员六十年代
吉林省队的主力，取得过全国单打第三的成绩，和许绍发，刘玉成是吉林乒乓三个主力
运动员，在吉林省队时和刘玉成一起发明了高抛发球，合力下蹲式发球，在入选国家队
时由于从未完工的楼上摔下来，腿骨骨折，错过了这次机会。这成为他的遗憾，后来他
培养了一些比较出色的运动员，其中王世慧取得过全国女子单打的冠军，入选国家队，
他的大儿子在84，85年两次获得全国单打亚军，和王涛，邓亚萍一起在国家青年队集训
。他在1973年的亚非拉乒乓球赛上担任过裁判长。撰写过《怎样打乒乓球》一书。
我和他约好到他儿子的球馆见面，我到时，他已经在球馆和一个年轻人练球，对方
拉弧圈，张老师推回去并且左右调动来练习对方的连续性和步伐，旁边的人介绍那个年
轻人是沈阳体育大学的学生专门学乒乓球的，张老师看见我来了，就停下来，指导他说
，“你要注意增强下肢力量，这是你的突... 阅读全帖 |
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b*******6
发帖数: 39 | 16 具体步骤基本是这样的：
1 PCR 50-100 ul体系，所得产物跑胶后回收，所有产物均酶切（大概5ug，可能很多，
但是太少了最后会看不到；Fastdigest推荐protocol是切200ng 1ul酶，10min；所以开
始的时候切3个小时，因为当初质粒3个小时能切下来；后来过夜切，出现2个条带；PCR
产物比比质粒难切）；质粒一般切4ug，3个小时（BamH1切1小时，Hind31小时，碱性磷
酸酶1小时），或者在Bamh1灭活之后Hind3过夜切（BamH1据说明书超过1小时就有星号
活性）；酶切体系50ul，Fastdigest酶各1ul。所有酶切产物切胶回收，nanodrop定量。
2 连接50ng质粒，50ng片段（大小比是5：1，所以数量比大概是1：5），10ul体系，室
温1小时或者4度过夜。
3 转化：5ul产物加入到50-100ul感受态，冰浴30min，42度热激90s，冰浴2min，加入
800ul LB，37度30-45min，3500rpm 3min 离心，留100-200ul混匀细菌涂板。 |
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b*********s
发帖数: 5382 | 17 ☆─────────────────────────────────────☆
blueandabl (blue mountain) 于 (Wed Jan 19 10:14:51 2011, 美东) 提到:
图片第6页
单眼皮画成双眼皮，这个话题在本版貌似个月经贴。简单聊一下
单眼皮画成双眼皮有很多方法，平时大家大多聊眼线的画法。今天我想大家了解一下欧式眼妆的画法。比对眼线更加自然。图为我的某客户妆前后的眼妆照。没有加任何美目贴，只是通过色彩完成。（由于手机拍的，效果比较差，大家将就看吧）
如果大家有兴趣，下次来分解画法。
PS：美目贴： 在专业化妆里，我们叫美目贴。其实就是双眼皮胶带，不是胶水。我们常常使用专业的胶带，区别于一般可购买的已塑形的胶带，根据客户不同眼形来剪成的。
大家都很注意此人嘴。我的重点在说眼睛！
实话说她的嘴没啥大的缺陷，颜色是客户自己选的，我已经告诉她不要用这个颜色了。她说她很喜欢这个颜色。所以就试给她看，反正是示范一下而已。
嘴巴的缺陷在化妆学上，无谓几种：过宽，过窄，过厚，过薄，鼓凸唇形，嘴角下垂，嘴唇平直。
其它嘴唇缺陷，化妆学是改变不了，要找整... 阅读全帖 |
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l*b
发帖数: 5305 | 18 啥叫好的手感打长胶就是浪费了？你是说打反胶需要手感打长胶不需要手感，还是说邓
亚萍等这些用长胶的手感不好，或是因为手感不好才打长胶还是怎么的？
我反复强调，但好像听者藐藐。包括手感啊这些东西都是相对的。你1500人的手感，
2500的看屁都不是，500的看，惊为天人。
至于说有没有实践，当然。你要说，切，你那个破水平，还在被动情况下主动求变，笑
死人！我也反驳不了你，我跟你不是一水平。但跟我一个水平的或是水平稍低于我的人
，应该不会因为我这样说来笑话我。我一直说了，一个水平说一个水平的话，跟水平相
当或稍低的人打，我觉得我还是常常可以在被动情况下主动求变的。比如，我要是看到
对方打一个位置比较舒服的时候，总是尽量往两边送送的。在比赛里，看到会打长胶的
，也尽量注意观察对方对方身形移动的特点，把球送得追身一点，让他不好打一点，常
常也都有不错的效果。
你说如果用反胶，别人接着拉就是了。话是没错，但节奏打乱了不是？上次紫荆杯，我
们的tt01惜败复旦的正反反长，其实tt01一直打的是上风球，大母体都说了，看着是要
赢的，但结果还是输了，输就输在对方长胶面和反胶面穿插使用，把tt01的节奏打... 阅读全帖 |
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k*******s
发帖数: 214 | 19 gDNA酶切有几个注意事项
1. gDNA一定要干净，质量好。酶切之前要跑胶看看。
2. 酶切体积要大些，1ug的要50uL体积更好
3. 酶要多加些，一般要总体积的5%
4. 酶切反应时间可以延长到overnight. 一般在反应几个小时后，可以再加几ul酶继
续切。
5. 最后跑胶应该是很好的smear现象。
酶切gDNA一帮可用来做Southern blot.
200ng/ |
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k******r
发帖数: 2243 | 20 长胶的六个最喜欢:
1.发下旋球的选手.对方发反手可以发力拱或切,发正手可以上手进攻,发得越转越吃亏;
2.只能拉一板弧圈的选手.挡过去的球相当转(要上步,迎前);
3.发球变化单一的选手.完全进入长胶的圈套;
4.打球犯急,情绪易激动的选手.还未弄清咋回事就下课了;
5.削球选手.削弧圈和削长胶的旋转刚好相反(除非削球选手也有一面长胶);
6.虽然也打长胶,但进攻不强的选手.
长胶的8个最害怕:
1、 不转球.特别是发球环节,能用同一动作发出转与不转,平时加强发球训练);
2、上旋球.由于胶皮本身的性能决定,长胶接这高种发球很容易出界;
3、 高吊弧圈球,如果没有倒扳技术,长胶真是没有办法;
4.两个大角的奔球,这可以说对长胶是致命的一着;
5.能连续爆冲的弧圈;
6.能进攻和弹打的生胶及防弧胶,由于这两种胶皮性能与长胶相近,同性相斥,互为克星;
7.发球好的选手,凡是遇到发球好的选手,长胶威力大减;
8.推挡好的选手,因推过来的球是不转球,因而长胶奈何不得. |
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k******r
发帖数: 2243 | 21 Someone posted this somewhere.
长胶的六个最喜欢:
1.发下旋球的选手.对方发反手可以发力拱或切,发正手可以上手进攻,发得越转越吃亏;
2.只能拉一板弧圈的选手.挡过去的球相当转(要上步,迎前);
3.发球变化单一的选手.完全进入长胶的圈套;
4.打球犯急,情绪易激动的选手.还未弄清咋回事就下课了;
5.削球选手.削弧圈和削长胶的旋转刚好相反(除非削球选手也有一面长胶);
6.虽然也打长胶,但进攻不强的选手.
长胶的8个最害怕:
1、 不转球.特别是发球环节,能用同一动作发出转与不转,平时加强发球训练);
2、上旋球.由于胶皮本身的性能决定,长胶接这高种发球很容易出界;
3、 高吊弧圈球,如果没有倒扳技术,长胶真是没有办法;
4.两个大角的奔球,这可以说对长胶是致命的一着;
5.能连续爆冲的弧圈;
6.能进攻和弹打的生胶及防弧胶,由于这两种胶皮性能与长胶相近,同性相斥,互为克星;
7.发球好的选手,凡是遇到发球好的选手,长胶威力大减;
8.推挡好的选手,因推过来的球是不转球,因而长胶奈何不得. |
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k******r
发帖数: 2243 | 22 Someone posted this somewhere.
长胶的六个最喜欢:
1.发下旋球的选手.对方发反手可以发力拱或切,发正手可以上手进攻,发得越转越吃亏;
2.只能拉一板弧圈的选手.挡过去的球相当转(要上步,迎前);
3.发球变化单一的选手.完全进入长胶的圈套;
4.打球犯急,情绪易激动的选手.还未弄清咋回事就下课了;
5.削球选手.削弧圈和削长胶的旋转刚好相反(除非削球选手也有一面长胶);
6.虽然也打长胶,但进攻不强的选手.
长胶的8个最害怕:
1、 不转球.特别是发球环节,能用同一动作发出转与不转,平时加强发球训练);
2、上旋球.由于胶皮本身的性能决定,长胶接这高种发球很容易出界;
3、 高吊弧圈球,如果没有倒扳技术,长胶真是没有办法;
4.两个大角的奔球,这可以说对长胶是致命的一着;
5.能连续爆冲的弧圈;
6.能进攻和弹打的生胶及防弧胶,由于这两种胶皮性能与长胶相近,同性相斥,互为克星;
7.发球好的选手,凡是遇到发球好的选手,长胶威力大减;
8.推挡好的选手,因推过来的球是不转球,因而长胶奈何不得. |
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C*******e
发帖数: 4348 | 23 反正你要胶回收的
酶切结束以后，只要是NEB的buffer 2,3 或者4，直接加点CIP进去37度1小时就可以了
然后一样胶回收
我不喜欢QIAGEN的胶回收kit
效率不高
绝对没有90%
lz可以试试ZymoResearch的胶回收kit
直接上他们家网站，要free sample
不喜欢也不用花钱买了 |
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x********e
发帖数: 35261 | 24 你们DNA胶回收都用的什么kit啊？效率如何？
我需要回收的DNA size在3-10kb间。我酶切2ug，跑胶（1%）回收。切下来胶质量大概1
00~200mg。
实验室有QIAGEN的kits。我试了QIAquick（旧kit），完全回收不了DNA。QIAEX II（全
新kit） 大概能回收500~800ng。根本达不到说明书上说的recovery rate。这属于正常
情况吗？
在网上搜了下，貌似QIAGEN的胶回收产品口碑不太好。我现在打算试试其他公司的产品
，希望找到一款简单又省心的产品。请克隆经验丰富的各位推荐一下~ |
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x********e
发帖数: 35261 | 25 你们DNA胶回收都用的什么kit啊？效率如何？
我需要回收的DNA size在3-10kb间。我酶切2ug，跑胶（1%）回收。切下来胶质量大概1
00~200mg。
实验室有QIAGEN的kits。我试了QIAquick（旧kit），完全回收不了DNA。QIAEX II（全
新kit） 大概能回收500~800ng。根本达不到说明书上说的recovery rate。这属于正常
情况吗？
在网上搜了下，貌似QIAGEN的胶回收产品口碑不太好。我现在打算试试其他公司的产品
，希望找到一款简单又省心的产品。请克隆经验丰富的各位推荐一下~ |
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j*j
发帖数: 5564 | 26 说到浙江各地的土产小吃食品，向大家推荐一位浙江金华的作家以及他的博客。
徐水法，浙江浦江人，中国散文学会会员，浙江金华作协理事等。
他的博客链接如下：
http://blog.news365.com.cn/sp1/shuigeliaoliang/
他的博客里有不少散文是描写他家乡的一些土特食品的来历和制作过程。下面转发的是
其中一篇。
切 米 胖
——年的滋味之二
切米胖是浙中浦江乡间的方言，米胖其实是冻米糖，也有地方叫“米花”、“米老头”
的。只有我的老家按邻县诸暨的叫法——豆糕，有什么出处，甚至字是不是这个写法，
我也没法确定，只好按音称呼。我老家把切米胖叫作胶（音读搞）豆糕，只有这“胶”
字作胶合解，才和实际有些相仿。
切米胖的准备工作得提前几个月完成，临近过年是来不及的。下半年后熟稻收割好了，
就按米胖需要的数量准备好糯米，其它米是绝对不行的。先淘好米沥干水，然后把米用
饭甑蒸熟，摊开冷却。待天放晴了，把米拿到太阳下晒，晒前得把米都用手搓散，连小
小的凝结米块也不行，一直把米晒干。我一直以为叫冻米糖比较贴切，正是缘于这米一
直在大冬天里挨冻受冷晒干的。
秋天收回家里的番薯在屋里 |
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f**********n
发帖数: 10757 | 27 说打法先进性，长胶反胶正胶什么的，那是对职业顶尖选手而言有点区别吧？对本版的
业余选手，你有哪个打法胶皮绝对牛逼？不是真觉得拿个反胶，就觉得有优越性了吧？
虽然我自己拿的就是反胶。
2300分打反胶的，随便拿个正胶板子，照样切一大堆人。 |
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g*****y
发帖数: 6325 | 28 为什么要这么高的浓度转化呢？ 我每次就切1ug. 胶回收，然后ligation, 转化都能挑
到正确得质粒。还有酶切一般我都不会
切超过2ug／tube. qiagen胶回收。 |
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发帖数: 1 | 29 以前家里花胶都是用来煲鸡汤，家里其他人都不吃(某人原话是：肥猪肉一样的口感)。
做菜的只好发掘新做法，网上搜来的这个菜谱还是靠谱的，起码家里大人小朋友都吃了。
做法
香菇或者冬菇挑肉厚的，泡发后把蒂去掉，清洗干净。泡香菇的水留用。
花胶泡发。花胶略冲洗一下，和室温水一起放入锅中，大火烧开后小火煮差不多十分钟
，然后盖上盖子，关火，闷到水冷却。然后用冷水冲洗干净，切小块。(如果是很薄身
的小花胶，时间应该要缩短，但是没弄过，无法提供意见。如果是比较厚的，要先冷水
泡一个晚上)花胶可以一次弄多一些，泡发好的放冰箱速冻，下次要吃，拿出来解冻就
可以了。
找一个厚底深锅，爆香姜葱。
然后加入泡冬菇的水，放一小把冰糖，加入冬菇，大火烧开后盖盖子开小小的火焖煮约
30分钟
加入花胶，继续焖煮多15分钟。
加入两汤匙生抽，两汤匙蚝油，三汤匙的水中加入三茶匙生粉勾芡，小火煮到你喜欢的
汁液粘稠度就好了。
实际操作时，请根据用料的多少以及自家口味调整一下冰糖和酱油、蚝油的用量 |
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D******6
发帖数: 841 | 30 下面附上的是本人20天前发的帖子：http://www.mitbbs.com/article_t/Pingpong/31650867.html
经过众多高人的热心回复和指点，我买了天极２，也试用了，不太行啊，粘性是很好，
搓球拉球都比以前质量更好了，但是弹性感觉弱了许多，正手进攻力量就小了很多，反
手推挡用以前的力度更是不过网。。。远台借力防守放高球也常常不过网。。。请高手
再指点一下吧，究竟是加强主动发力适应新胶皮，还是换成粘性差一些但弹力好一些的
Tenergy，还是换回以前的貌似两者都不错的Baracuda Big Slam @ Donic。。。纠结啊
。。。
Btw，背景：底板Taksim @ Butterfly，反面是带0.6mm海绵的天津大维388D-1长胶（颗
粒尖上还有小颗粒），本人是力大无穷肌肉男，但常靠反手搓极转球以及大量使用反面
长胶造成对方失误得分，正手主动进攻较少、拉球更是少而差，这个正手短板是我亟待
解决的问题。
发信人: DaXia666 (一代大侠), 信区: Pingpong
标 题: 【求教】应该用哪一款反胶胶皮？Tenergy or Baracu... 阅读全帖 |
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h**********r
发帖数: 671 | 31 以前好好的。接着几次跑胶小片段都有点弥散，不知道原因。左图是筛克隆时的双酶切
，质粒是按《分子克隆》的碱裂解法提的。右图借用别的lab的qiagen的试剂盒提的然
后双酶切。问题也可能出在loading dye上。按《分子克隆》配的6X,40% sucrose加上
两种染料。EB是直接加在胶里的。大家看看吧，多谢！ |
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r***u
发帖数: 1272 | 32 高考之前流传一句话“二十一世纪是生物的世纪”从此就跳进火坑了有没有！！！！！
考得比谁都高学得比谁都苦考了笔试考实验最后收入比谁都低！！！有没有！！！！！
一进大学就开始狂背这辈子除了考试就用不到的东西有没有！！！！
鸟适应飞行的进化十大特征！ 三碳循环！二十个氨基酸中文名！！！！！
英文名！化学式！化学结构！性质特征！
最变态的还有代谢途径 ！！！！！
氨基酸有多少种代谢途径有没有！
背什么生糖氨基酸 生酮氨基酸 生糖兼生酮氨基酸！！！！
你以为生完酮就完了？根本没完！还有分解转化！
转成糖有没有！转成脂肪有没有！
不要以为吃了蛋白质不吃脂肪就不会长胖有没有！蛋白质可以转化为脂肪的！
你以为把氨基酸代谢背完了就完啥了！没完！！！！！！
还有糖代谢！糖氧化！糖酵解！脂肪代谢！脂肪酸代谢！核酸代谢！有没有！
DNA完了RNA RNA完了rRNA, rRNA完了mRNA，然后RNAi！！！！！
你有完没完了！！！
原核遗传学完，还有真核遗传！
这还只是一门课有没有！！！！！
你说学生物的人不正常！背下来这么多没用的东西还能正常么！！！！
学GRE的说自己成天背得痛苦！
学生物的每门课课本都... 阅读全帖 |
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i*****r
发帖数: 65 | 33 学生物的你伤不起zz 应个景（转）~~~
高考之前流传一句话“二十一世纪是生物的世纪”从此就跳进火坑了有没有！！！！！
考得比谁都高学得比谁都苦考了笔试考实验最后收入比谁都低！！！有没有！！！！！
一进大学就开始狂背这辈子除了考试就用不到的东西有没有！！！！
鸟适应飞行的进化十大特征！ 三碳循环！二十个氨基酸中文名！！！！！
英文名！化学式！化学结构！性质特征！
最变态的还有代谢途径 ！！！！！
氨基酸有多少种代谢途径有没有！
背什么生糖氨基酸 生酮氨基酸 生糖兼生酮氨基酸！！！！
你以为生完酮就完了？根本没完！还有分解转化！
转成糖有没有！转成脂肪有没有！
不要以为吃了蛋白质不吃脂肪就不会长胖有没有！蛋白质可以转化为脂肪的！
你以为把氨基酸代谢背完了就完啥了！没完！！！！！！
还有糖代谢！糖氧化！糖酵解！脂肪代谢！脂肪酸代谢！核酸代谢！有没有！
DNA完了RNA RNA完了rRNA, rRNA完了mRNA，然后RNAi！！！！！
你有完没完了！！！
原核遗传学完，还有真核遗传！
这还只是一门课有没有！！！！！
你说学生物的人不正常！背下来这么多没用的东西还能正常么！！！！
学GRE的... 阅读全帖 |
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s******a
发帖数: 472 | 34 现在大部分实验室还是用EB染DNA吧
大家做克隆的时候DNA割胶纯化会把DNA暴露在UV下吗？
我以前一直在UV下速战速决切胶
现在在的新实验室好麻烦
在一块胶两边各留一个lane，load相同的东西，然后两边的两个lane先切下来在UV下
mark目的条带位置，最后用mark的位置blindly切目的条带。
这么短暂的UV暴露导致的突变会显著影响结果吗？ |
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j****x
发帖数: 1704 | 35 很久很久没做胶回收了，但是Qiagen的Qiaquick印象中还是不错的，得率应该在50%的
样子。其实胶回收得率的关键在跑胶而不在kit，各家柱纯化kit的效率基本都在90%以
上，但是很多时候一个样品从上胶到切下来就已经损失了50%甚至更多了。
不过QIAquick有个缺点，就是溶胶buffer的用量是3倍gel slice的体积，稍微大一些的
gel slice就得分好几次离心，这点很不爽，所以后来就换成Fermentas家的GeneJET，1
倍gel slice的体积的溶胶buffer，效率也很好，还便宜。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 36 你切胶纯化留下的是PCR产物这个没问题，但是那个胶亮的地方里面不是只有你想要那
个片段，很多乱七八糟的genome瞎扩的东西被优势产物夹住了只能跟大家一起跑，虽然
你的目标带是绝大部分。一般加了样 的well都比旁边的亮一点，就是因为乱七八糟的
DNA背景。
所以要nested 这样第二对引物只有你的PCR产物可以结合上去，才能纯。而且第二次
PCR出来去跑胶，well那一长条稍微亮点的就完全没了。如果条件受限nested也可以只
有一端。
另外为神马第一个PCR不要跑完，因为普通PCR有错配，如果跑完36个循环，你会稀释很
多，这样你可能正好挑到错配的产物造成你认为KI失败，所以跑个十来个循环富集一下
模版就可以了，这一步不用纯化。
我说得这个方法整个不用纯化胶的kit，需要的是纯化PCR产物的kit。跑胶是为了检验
你的PCR，但是你寄去的是你点样留下来的。
QIAGEN |
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e***o
发帖数: 344 | 37 最近跑DNA胶很邪门，首先是基因组DNA的条带大小在不同的胶里跑得不一样。做3C-
library，所以在提取的过程中没有除去蛋白质，用裂解液裂解细胞后，离心收集细胞
核，再分别用SDS和Triton X-100裂解细胞核后跑的琼脂糖胶。
其中2，3泳道是刚提取完时跑的电泳条带，1，4孔道是将同样的样品放置6个小时左右
后跑的电泳条带，结果条带大小就发生了改变，有15000bp左右减小到了几百bp，而且
每次跑胶，电泳条带的大小都不固定，大多都只有几百bp，和基因组大小不符！
然后是回收cDNA500-700bp的带加adapter,扩PCR也出现这种飘移现象。到别的lab也试
了，还是这样。跑别的特异PCR扩增和酶切质粒都是好好地。真是邪门了。
请大家分析下是什么原因造成的。谢谢！ |
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r**i
发帖数: 514 | 38 dna纯度对酶切效率有影响。
最好每次不要切很多，可以分多份切。
也算是在分子这块混迹十几年，再拿这个弱智问题来请教高人实在不堪。直接说吧，低
拷贝数质粒，要切的量很高，要求回收后能达到100ng/ul. 没办法，猛养细胞，猛提质
粒，所有的试剂盒被我抛弃，达不到我的要求，还费钱。手提，溶液1，2，3乙醇沉淀
什么的折腾，量上基本没有什么问题。 两个酶，Asc I 和 Not I, 双切，感谢NEB,这
两个酶现在可以在同一个buffer里切，回收，问题来了，总是切不干净，转化后总有空
质粒，极度讨厌这个转化后的空质粒。酶切的时间都是超过24h， 酶的量也大大的多。
请问这是为啥？ 这还能切不干净？ 还有一个引申问题，是不是所有的酶切都是切不干
净的，如同化学里面的只能达到平衡？请高人指点。
附加问题，达人们有无什么胶回收试剂盒推荐？ 我总觉得现在用的QIA和Promega的效
率不好，从没有达到所说的90% |
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A*******e
发帖数: 284 | 39 也算是在分子这块混迹十几年，再拿这个弱智问题来请教高人实在不堪。直接说吧，低
拷贝数质粒，要切的量很高，要求回收后能达到100ng/ul. 没办法，猛养细胞，猛提质
粒，所有的试剂盒被我抛弃，达不到我的要求，还费钱。手提，溶液1，2，3乙醇沉淀
什么的折腾，量上基本没有什么问题。 两个酶，Asc I 和 Not I, 双切，感谢NEB,这
两个酶现在可以在同一个buffer里切，回收，问题来了，总是切不干净，转化后总有空
质粒，极度讨厌这个转化后的空质粒。酶切的时间都是超过24h， 酶的量也大大的多。
请问这是为啥？ 这还能切不干净？ 还有一个引申问题，是不是所有的酶切都是切不干
净的，如同化学里面的只能达到平衡？请高人指点。
附加问题，达人们有无什么胶回收试剂盒推荐？ 我总觉得现在用的QIA和Promega的效
率不好，从没有达到所说的90% |
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W**T
发帖数: 18996 | 40 用长胶， 不拱， 不磕， 不抹， 不切， 不撇， 却用长胶反手拉， 反手打， 反手拍
， 反手攻。
这用长胶干嘛？
倒是丐帮的正手进步的厉害， 换了太内机之后， 旋转强了不少， 今天档飞了不少。 |
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l******0
发帖数: 150 | 41 1）酶切产物不纯，run胶后切胶回收，转染细胞，如果是细菌的话直接做感受态，如果
是植物用农杆菌，用电击，用PEG，动物细胞可以用基因枪、电击和PEG
2）检测表达部位可以使用GFP或者GUS标记，筛选细胞使用PCR、Real-time、DNA测序、
Southern、Western blot，检测产物可以用GC-MS，HPLC，LC-MS，GC-Tof等，高通量的
可以使用Microarray，办法有很多，因需要而异
3）不明白什么是跑出来？跑出细胞核？出来还怎么表达？ |
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d****i
发帖数: 2346 | 42 第一轮产物泡脚，在你目的片段预期大小的位置切胶回收，胶切取的范围可以稍微大一
些，纯化后再做第二轮用梯度PCR。 |
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s*********t
发帖数: 600 | 43 请问什么是intact protein？不都是得酶切成肽段吗
帮我做质谱的地方说不要溶液，只要切胶。这也是我不想再找他们的原因，直接打溶液
总比切胶，要少损失一些蛋白，灵敏度也高吧？ |
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u*********1
发帖数: 2518 | 44 正在制作用于whole-genome sequencing的human genome library。做完ligation跑胶
看到smear，然后切下比如450-500bp的区间做PCR。但可能是50bp的interval太小或者
自己技术不好，所以最后PCR出来的亮度比较低。（当然也不排除ligation efficiency
不好）
PCR的结果如图。
还没拿去测浓度。只想问问有经验的前辈这样的情况能拿去测30 coverage的WGS吗？
另外还有一个问题，就是，我们切胶的smear每一个区间（300-400，400-500，500-600
）这些区间里都一定cover了genome的每一个部分吗？我总担心genome的有的部分没有
被涵盖到，那岂不是就人为引入了很多bias？
thx |
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w********a
发帖数: 324 | 45 大家都在用Gibson Assembly吗？
大家的vector backbone和insert都是切胶纯化的吗？怎么发现切胶后，效率很低，转
到大肠杆菌以后一般很难得到colony。
大家遇到同样的情况吗？有经验的说说。
非常感谢！ |
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w********a
发帖数: 324 | 46 我现在的问题是如果用切胶纯化，转到大肠杆菌以后基本得不到colony； 而如果只是
简单的用PCR cleanup的kit纯化的话，因为insert PCR产物经常有杂带 （而且杂带比
实际的insert要短很多，所以被连上的效率会比insert高很多），分离出来的
construct经常是乱七八糟。
你如果增加互补序列的长度的话，一般增加到多少bp？这样的话，你用切胶纯化也完全
没有问题吗？
另外，进行G.A.反应的时候，你们都是按照Neb推荐的量加的backbone和vector吗？谢谢 |
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z*******n
发帖数: 101 | 47 看切胶回收的亮度吧, 一般切胶回收也就50-60 ng/ul浓度吧，vector2ul insertion
3ul, 反应完转化Soc recovery时间长点至少2小时。 |
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p*****n
发帖数: 981 | 48 ☆─────────────────────────────────────☆
sixtn (人在天地间如风中飞絮!!!) 于 (Mon Jan 29 00:24:15 2007) 提到:
最近，我在做一个双酶切的连接。最开始，在已经联入T simple vector的A段DNA序列
的一端有相隔四个碱基的两个酶切位点（XbaI和BamHI），然后用双酶切的方法把B段
DNA序列（两端带有相同的两个酶切位点）连进去。跑胶和回收都没有问题，大小也对
。但用T4酶或其它连接试剂盒连接后，再转化，总是长不出来。但其它同学用相同的试
剂做其它连接却能够轻而易举的长出来。已经做了三次了。对于原因百思不得其解，回
想实验过程是再简单不过，加液体这些也很难出错呀。化转也是很简单的步骤。不知道
哪里可能出问题了。
各位ggjj帮我分析一下可能原因好吗？多谢！
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goooo1111 (i!) 于 (Mon Jan 29 00:33:53 2007) 提到:
相隔四个碱基是不是少了一点？有些酶不切DNA尾巴， |
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x*****e
发帖数: 309 | 49 看来做酶切的人还不少。其实双酶切分两步应该可行，先用对酶切要求比较高（查NEB
附录上需要保护碱基较多的酶）的酶切，反应完后加直接加第二个酶切：不用回收DNA
。这里有人问buffer不同怎么办的问题，查查哪里不同，一般也就是NaCl浓度差异，缺
啥补啥，自己加点调成第二个酶用的buffer就可以了。我现在空质粒双酶切完直接乙醇
沉淀回收（小片段沉淀不下来？）：加2倍体积无水乙醇，可选加1/10体积3M醋酸钠，-
20度大于20分钟，14000rpm*15min回收DNA,70% 乙醇洗2遍，风干后10-20ul水溶解（1-
2 ug DNA），如果有大的插入片段就走胶回收吧。 |
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A*******e
发帖数: 284 | 50 请问我两个酶有共用buffer，为什么还要分布切呢？ 空质粒双切后直接乙醇沉淀
后做克隆可以吗？ 这样没有背景？我决定切下拉的片断应该也能沉淀下，这样就会有
背景啊。愿闻其祥，请赐教啊。
曾有labmate双切后用PCR纯化试剂盒做回收纯化，一直不成功，我提醒说这样酶切
的片断也能回收回来，不要迷信回收试剂盒，什么多大的片断回收不下来之类的全不可
靠。后来换胶回收就成功了。
NEB
DNA
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1- |
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