h****g
发帖数: 439 | 1 这是个困扰我很久的问题。还有，为啥我们用rosa yfp 比较多，为啥不用rosa gfp呢？
还有，为啥rosa rfp 的老鼠能用肉眼看到红色，为啥yfp的小鼠没有颜色呢？
还有，为啥yfp的信号要用PFA固定保存呢？
望达人解惑！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 2 1. the color of YFP: it is green-yellow, so if you don't have a control
color (like the real green), it will looks green. Plus, part of its spectra
will go through the green filter.
2. RFP is activated by green light, which is abundant in natural light.
YFP is activated by blue light, which is NOT abundant in natural light.
In order to see bright fluorescent of YFP you will need to use special
activation light source.
3. Conservation of the fluorescent light: it is important to keep the
structur |
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m*****u
发帖数: 15526 | 3 用的Cre YFP reporter mice.想观察YFP+细胞在皮肤分布情况。4%PFA固定后镜下看发
现有自发荧光。也可能YFP有淬灭，很难区分。求哪位大佬给一个好用的protocol。包
子酬谢。 |
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a*****s
发帖数: 131 | 4 Why do some of my Rosa26-loxP-stop-loxP-YFP mice show YFP+ even without Cre
or anything else?? Does anyone have experience with these mice from Jax?
Thanks! |
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h****g
发帖数: 439 | 5 sunnyday真是《十万个为什么》啊
还有个问题，我们实验室的荧光显微镜上，有一个蓝光channel，一个绿光channel，这
两个channel都能看YFP信号和FITC信号。 这两个channel有啥区别
spectra |
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s******y
发帖数: 28562 | 6 In most microscopes, the "color" label of the channel means the excitation
light permitted by the filter cube (or other spectra dividing instrument)
inside. Therefore, the "blue" channel should be used to visualize GFP, YFP
or FITC, and the "green" channel should be used for TRITC or RFP.
Most likely you guys put in two filters with similar cutting ranges,
and arbitrarily label them as "blue" and "green" but it is not really "blue"
and "green". So don't take these label too serious. If you reall |
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s*****j
发帖数: 6435 | 7 excitation max of YFP is 514nm, which is not blue.
spectra |
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p******d
发帖数: 3737 | 8 不是GFP，是YFP的antibody，做IF。实验室里面有的都是主要做GFP的，试了一下，不
太好。 |
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m*****u
发帖数: 15526 | 9 已经用了YFP,不想再花时间构建另外品系。不过谢谢建议 |
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s******y
发帖数: 28562 | 11 大部分polyclonal anti-GFP 抗体也能识别 YFP的。 |
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P****o
发帖数: 172 | 12 We use Chicken (IgY)-anti-GFP (Invitrogen, A10262) to detect YFP on 2% PFA
fixed tisses. It works very well. |
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h*****4
发帖数: 36 | 13 4%PFA 会严重削弱YFP的荧光信号 听说用2%的PFA或许会好很多。不知能不能尝试一下
看看。 |
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s****9
发帖数: 932 | 14 My two cents:
How protein can be expressed with a stop code, which cause a frame shift?
For my personal experience, I used Rosa-Stop-YFP mice from JAX and cannot
see any leakage in Cre negative mice in any lymphocyte populations.
It's a transgene and thus it is possible that the insert allele can move and
incorporate into other promote region. In that case, you just need to
refresh your line and get a new breeder from JAX.
stronger |
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D*a
发帖数: 6830 | 15 我打算做冷冻胚胎切片。以前是sucrose/gelatine包埋，现在是冷冻剂包埋，用的是
FSC22 leica，哪种好呢？另外如果我直接包埋有什么需要注意的事项吗？没做过。
以前用的是sucrose之后 sucrose/gelatine包埋。好处就是冷冻之前完全透明，可以切
割，到时候冷冻之后不用一个劲的摇手柄找tissue。坏处呢就是我没做过我现在这种，
不知道37度一天对YFP荧光有没有影响。
sucrose之后直接OCT包埋有什么优点呢？现在实验室用的是冷冻剂包埋（FSC22 leica
），对我的好处就是protocol半现成（paper上扒下来的），可以直接跟以前的图对比
。话说OCT是什么的缩写？FSC22是不是一种OCT，还是OCT有特指？
多谢指教！ |
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D*a
发帖数: 6830 | 16 我以前用的是TomatoRed在brain里 那个红通通啊 换了YFP 换了organ 换了年龄 我也
不敢瞎搞啊 |
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z****u
发帖数: 1007 | 17 可以固定后直接OCT包埋。不过sucrose， OCT浸泡后再包埋形态会更好。sample不会是
透明的，PFA固定后都是有些褐色的，很容易就知道切到哪里了。
37度一天对荧光没有任何影响。别说一天了。。我的需要脱钙的sample经常室温EDTA脱
钙个把星期都没问题。 TdTomato非常稳定。 YFP我不太喜欢，也不是很熟悉其稳定性
。 |
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m***i
发帖数: 2013 | 18 感谢二位的答复。
问题源自我想设计一个实验，用interchangeably转换蓝光、红光来刺激细胞（
channelrhodopsin）同时记录钙信号（RCAMP）。如果chr2连接的YFP有荧光逗留就会污
染钙信号，就没法做了。还好它的起、灭时间都很快，应该没问题。 |
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f***4
发帖数: 886 | 19 这个很正常的。
检查一下你的TARGET载体构建和ROSA-YFP是不是一样，就是说整合在ROSA的位点是不是
一样。
现在存在的ROSA-YFP要比ROSA-GFP表达强很多倍，解释的原因很多，很多人同意就是整
合的位点不一样。
invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
lox |
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s***e
发帖数: 911 | 20 Sunny Xie最近有个工作,是在bacterial level理解epigenetics. 方法是在Lac genes上
标记一个YFP， 然后用显微镜定量每个E.Coli的荧光强度. 从一个single e.coli开始,
跟踪观察其后代. 因为Lac repressor的关系, YFP表达是比较低水平的. 随着分裂继
续, 一个pheno type出现，这些e.coli具有高表达的YFP. 这个特征可以遗传下去.
解释: e.coli里只有几个Lac Repressor. 一个reporessor有两个DNA binding sites.
热力学上具有很小的机会让这个repressor完全离开DNA. 一旦完全离开, 因为inducer
会compete bind 到repressor上, 则rebinding的kinetics会非常慢. 于是在一个相当
长的时间内, 这些e.coli的特性会遗传到下一代.他强调的是, 至少对他研究的这个
model system来说, epigenetics无非是一个小概率偶发事件, 并且远离热力学平衡态
的结
果.
我这也是报告会上听的。不 |
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g*********d
发帖数: 233 | 21 RNA干扰及其在动物繁殖中的应用
2009-12-28
RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是生物进化过程中遗留下来的一种在转录后通
过 RNA 调控基因表达的机制, 它是指在真核细胞中引入双链 RNA分子从而导致具有序
列同源性的基因产生特异性基因沉默 (gene silencing)的现象 。由于 RNA干扰可以阻
断特定的基因表达, 具有超越疫苗和抗病毒药物的诸多优点, 因此在阐述基因功能以及
蛋白质相互作用等方面, 表现出诱人的前景。近年来随着分子生物学的发展, RNAi 的
机制也不断被阐明, 同时国内外研究也证实 RNAi 技术可以为动物繁殖过程中所涉及的
基因功能提供一条新的思路, 这在科研和生产实践上都具有重要的意义。
1 RNAi的发现
Matzke 等于 1989 年报道了启动子介导的序列同源性基因共转染烟草可引起转
基因表达发生沉默。 1990 年, Napoli 和 Van der Krol 等为了让矮牵牛花的颜色更
加鲜艳, 把与紫色相关的查尔酮(chalcone)基因转染到牵牛花内, 结果意外发现, 植物
体的颜色... 阅读全帖 |
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a*******u
发帖数: 19 | 22 A-CFP和B-YFP（或B-CFP&A-YFP）共转HEK293T，COS7，使用lipofectamine 2000转染（
按说明书操作）48小时后，细胞中只有A-CFP或B-YFP，但是没有2个蛋白一起表达的细
胞。A在80 kD左右，B在90kD左右，是不是A和B蛋白太大，两个不容易一起表达？如果
将用A的剪切体约45kD再和B全长去做FRET估计能共表达吗？
Hela里共转Flag-A和His-myc-B的时候A表达很低，所以就没试；293T和COS7中Flag-A和
His-myc-B共转都没问题。 |
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L***s
发帖数: 133 | 23 做了只转基因小鼠，lox-STOP-lox-gene-EGFP，EGFP是fuse在gene的C末端，target的
位置是ROSA26。
体外细胞试验很好, Cre转染后大量的GFP表达，功能也没问题，该基因不toxic。
好了，小鼠做好后，与Nestin-Cre line 杂交后，兴冲冲做了IHC (rabbit GFP Ab, invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
帮忙分析一下原因
1. Fusion protein的问题？可能是fusion protein 表达量低？或是表达量可能并不那
么低，但在PFA fix时导致fusion protein被mask了，所以IHC看不到，证据是lox/lox
比lox/+的阳性细胞要多些。试了citrate buffer antigen retrieval (pH6, 95C,
15min)， 结果更差，一点阳性细胞也没有了。其他可行的antigen retrieval 方
法？
2. 因为target的位置... 阅读全帖 |
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m*****u
发帖数: 15526 | 24 我用flow cytometry 测核内transcription factor就得用methanol处理。同时想看细
胞YFP荧光基本上就不可能了。如果哪个大虾有合适的protocol,不淬灭YFP,同时又能标
记上transcription factor的，麻烦提供一下。包子酬谢。有好的flow cytometry 用
的抗YFP荧光抗体，能标记上methanol处理过的细胞的也行。 |
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w*****2
发帖数: 1458 | 25 https://images.search.yahoo.com/images/view;_ylt=AwrTcYQ5LklavOkAGRKKnIlQ;_
ylu=
X3oDMTIzMjV0bzdjBHNlYwNzcgRzbGsDaW1nBG9pZANhY2ZmNmE5NDQ4OTdmNDYzMjNlNTkwYjY2
Yjc0ZjRlNwRncG9zAzQ2BGl0A2Jpbmc-?.origin=&back=https%3A%2F%2Fimages.search.
yahoo.com%2Fsearch%2Fimages%3Fp%3Dwhere%2Bwas%2BJesus%2Bborn%26fr%3Dyfp-
hrtab%26fr2%3Dpiv-web%26tab%3Dorganic%26ri%3D46&w=500&h=500&imgurl=i1.sndcdn
.com%2Fartworks-000004105074-9aqpwj-t500x500.jpg%3Fdebc7fd&rurl=http%3A%2F%
2Fsoundcloud.com%2Fisthisthomas%2Fjesus-... 阅读全帖 |
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a*******u
发帖数: 19 | 27 CFP,YFP,GFP,RFP tagged protein去做confocal，但我的师姐说那样也不太令人信服不
能算是直接的证据。
不明白更复杂FRET怎么做，只知道CFP and YFP能做直接的相互作用，但是即使两两的
相互作用也不能说明3个或3个以上在一起，两个之间可以有竞争性排他占据的作用。
nondenaturation gel，能不能给个paper和protocol，听起来如果运气好的话，就能做
出来，而且成本或比较低。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 28 我们也有类似经历，不过幸运的是我们转进去的只是一个单独的GFP
reporter, 看不到就拉倒了，反正有其他方法来知道哪个是transgenic老鼠.
我们的感觉是很多转进了老鼠内部的基因会有可能被体内的机构关起来不让
表达，或者表达大大降低。
你的情况，最好是这样：
１。把组织提出来做western blot
2. 用anti-GFP 来加强荧光。
我们一向都用Roche mouse anti-GFP，他家的抗体stock solution稀释得比较高，所以
用的时候不能稀释太多(所以比较不经用），但是特异性比较高。
invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
lox |
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n********k
发帖数: 2818 | 29 also fusion-GFP sucks most of time...
invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
lox |
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l*********i
发帖数: 332 | 30 how in vitro experiments are done exactly? details.
what kind of cell, what exactly construct have you used?
invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
lox |
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r******y
发帖数: 21907 | 31 如果两个construct来源不同，能反应吗？比如一个是gateway system，一个是一pUC19
为Backbone的需要连接克隆的，两个分别带有N-YFP和C-YFP，这样转化后可能出结果么
？觉得不可能。 |
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p******d
发帖数: 3737 | 32 想看YFP啊。做YFP的paraffin的staining不work啊！！！前两天还上来问来着的。忒悲
催了！！！ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 33 Continue again:
YFP/GFP/Luciferase etc bioluminescence marker methods
for measurement of clearance rate constants within living cells
please refer
Science 2011 paper (YFP):
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21233346
and 2012 paper (GFP) :
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22499809
Ps:
Below both figures were from 2012 Science paper its Supplementary Materials document,
web link:
//www.sciencemag.org/content/early/2012/04/11/science.1221920/suppl/DC1
Good Luck for your CNS revised version submission. |
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l*****5
发帖数: 197 | 34 大家好，现在遇到一个问题不知道怎么解决，希望在此得到帮助，不甚感激！
我用recombinent protein 做一个in vitro assay，最终希望得到一个比较纯，浓度比
较高的dimer，所以一个是His tag，另外一个是GST tag，计划用两次纯化得到最终产
物，其间涉及到另外三种enzyme,实验室以前别人做的，都是His tag。
按理说，整个反应的过程没有多大难度，有一些文章也有receipe，但因为我需要的是
最终的产物，然后再接着往下做别的，所以希望能做的多一些，也需要浓度大一些。但
我已经试了3、4次了，基本上每次做都会缓慢的出现絮状的沉淀，就好像蛋白变性的那
种感觉，会不会是我用的反应浓度比paper上的浓？但我需要的量比较大啊。。。lab以
前的师兄做过，效果还可以，我的浓度是他的5倍，而且总体的量也多很多，他以前做
的量都比较少，也不需要纯化之类的，师兄毕业走人了，而且他一直就用比较稀的浓度。
还有，我试着将离心后的上清过Thermo Pierce的glutathione agarose beads,可以看
到蛋白有吸附（有YFP tag），但我最后... 阅读全帖 |
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w**f
发帖数: 38 | 35 To define MMTV-Cre expression pattern, I crossed MMTV-Cre mice with Rosa-YFP
reporter mice. Very nice GFP fluorescence signal was seen in ductal trees
of Cre-postive/Rosa-YFP (+/-) mouse mammary glands. I then isolated mammary
epithelial cells using the Stem Cell kit (Collagenase/Hyaluronidase
digestion). No GFP-positive cells were detected using FACS analysis. Can
anyone give some suggestions on how to preserve GFP for FACS? Or can anyone
recommend one good protocol to cut sections from frozen ... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 36 用GFP UV-corissing immunoprecipitated mRNAs assay
pls refer,
>
GFP-Based Method for Detection of mRNA-Protein Interactions
HeLa cells expressing N- or C-terminally EGFP/YFP-tagged proteins (Table S7)
were induced with tetracycline, irradiated with UV light, and lysed. GFP-
binding protein (GBP; GFP agarose trap, Chromotek)-immunoprecipitated mRNAs
were detected using an oligo(dT)25 probe fused to TRed dye (Sigma).
RNAs coimmunoprecipitated with GFP/YFP-tagged proteins were identified by
RNASeq. D... 阅读全帖 |
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D*a
发帖数: 6830 | 37 赞，漂亮~
我现在的问题是，有一个基因，我前任认为是有个新功能在ENS里面，因为用ROSA YFP
看到有标记。我最近做了一下觉得是leakage，而且怀疑不是或者不仅是漏到ENS里面，
而是到其他周围神经系统（看其他paper想到的）。所以我们已经有YFP表达了，现在的
问题是我们谁对......（坑啊！！！）我们也有Wnt1-Cre，但是不能两个cre同时啊...
PS 我或许可以把整个GI track连同到脑干的神经纤维束一起分离出来然后wholemount
染色？切片不是很好定位，而我总觉得以前我拽食道的时候就把纤维束拽断了，所以看
不到，没大有说服力。 |
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h*******n
发帖数: 8906 | 40 今天雅虎转的文 这么悲观的看法 不容易
Ohio Democrats watch in dismay as their state tilts red
https://thinkprogress.org/ohio-democrats-watch-in-dismay-as-their-state-
tilts-red-ad045b8921c6?ref=yfp#.dcd2ezgpy
有一段谈early vote
Early voting tallies paint a darker picture. So far, 300,000 fewer people
have voted this year than at this same point in 2012 — in large
part because the state slashed the entire first week of early voting
— and the biggest drop-offs have been in blue strongholds.
还有c... 阅读全帖 |
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p***n
发帖数: 17190 | 41 http://tw.search.yahoo.com/search?p=%E7%A2%98+%E9%8A%AB&fr=yfp&
碘131及銫137
碘131
自然界半衰期：8天
人體半衰期：5天
對人體主要影響：甲狀腺，可能導致甲狀腺腫瘤。
對策：缺碘的人會吸收比較多、大概吸收80%，碘充足者，相對吸收少，則只會吸收10%
。平常可以適度食用海藻、海帶。危急時須服用碘片的話，總共要吃3片，可降低吸收
至1%到2%。
銫137
自然界半衰期：30年
人體半衰期：70天
對人體影響：散佈在全身細胞，對輻射敏感器官特別有傷害，特別是乳癌。
對策：多喝水，可以協助排出，暴露時儘快就醫，在醫院有解毒劑、螯合劑等可供治療。
資料來源：林口長庚醫院臨床毒物科主任林杰樑
整理：記者洪素卿 |
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P******l
发帖数: 1648 | 46 本文转载自最新一期的使者杂志
http://tiny.cc/20170304-am-evolution
当科学与信仰交集时——进化论是科学吗？ /张纪德
许多基督徒及慕道友对科学与信仰方面的讨论感兴趣，但要小心一些似是而非的认知。
使者杂志59|6期的《生命演化与基督信仰》一文，笔者觉得有诸多可商榷之处。比如说
:「演化本身有充分科学证据的生物机制」(p 48 右上）；又说，「从最简单的形式开
始……上帝掌管生命演化的机制……」(p 49 左）等，均不恰当。
或许有些人不清楚，演化论就是进化论（Evolution）， 与达尔文主义（Darwinism）
同义。在一般教科书及报导文章里都把进化论当科学；但是，各种生物是进化来的吗？
生物在演化吗？
历史沿革
自1859 年达尔文发表《物种论》以来，进化论对科学及宗教信仰起了很大的影响。许
多知识分子全盘接受达尔文的进化论，以至达尔文主义成为一种世俗的意识形态，与宗
教信仰有很大抵触。
近百年来，有部分神学家在解经上妥协，以进化论的框架来解释圣经，发展出各样版本
的 「神导进化论」新派神学。
多数的神学家、牧师一再努力抗拒新派神学，但... 阅读全帖 |
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M****e
发帖数: 70 | 48
this is very neat work. they used the nematode to address the factors that
are involved in localization and formation of stereotyped synapses. they
found that vulval epithelial cells are involved in the formation of synapses
at the vulva between HSNL and VC neurons.
talking about the general strategy, they first used YFP or GFP directed by
certain promoters that are "specific" to the synapse as markers, and they
demonstrated that they could visualize the formation of synapses near the
vulva. w |
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h****g
发帖数: 439 | 49 不同组织处理和固定方式的对FITC-Dextran的影响：
1，tumor tissue-OCT-section-acetone: fail
2, tumor tissue-OCT-section-PFA:fail
3, tumor tissue-PFA-sucrose-OCT-section: work!
看来FITC-dextran 和YFP一样，要用PFA固定，然后再OCT |
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b*****l
发帖数: 9499 | 50 是 band through 的 cube 还是简单的 band splitter？
use |
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