b*****l
发帖数: 9499 | 1 r u sure?
in my lab, blue is labeled as DAPI, green FITC, and red RHOD.
blue"
，这 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 2 Well, people label whatever they like for those channel and there is no
universal way for it. The microscope industry generally lable the channel as
the excitation light because it is more appropriate, but the laboratory may
have their own mind and can easily change the label to whatever they like. |
|
p*****r
发帖数: 805 | 3 我想Sunnyday的意思是，mercury lamp的光通过excitation出来的光的颜色（肉眼看到
的，objectives照到样品上的颜色，不是eye piece里看到的颜色），如果是“蓝色“
，那么通常是GFP或者FITC的filter（eye piece里应该看到绿色的fluorescence)；如
果是“绿色“，那么往往有可能是TRITC或者RFP的filter(eye piece里应该看到红色的
fluorescence）。 |
|
b*****l
发帖数: 9499 | 4 这个我当然知道。我是说，大家通常 label channel 时是按啥规范？
我从未见过按 excitation 来 label channel 的。。。俺的显微镜自带的 label 最短
也就是 DAPI 了。要是按 Sunnyday 的意思，岂不是还要附带一个 label 上面写明 UV？
查了一下几家公司，有显微镜公司，有卖 antibody 的公司，还有说明书，都是按
emission 来 label 的。
大家的实验室都是怎么 label 的？ |
|
b*****l
发帖数: 9499 | 5 应该有约定俗成的业界标准的，否则交流起来岂不要乱套误事了。
as the color of the excitation light because it is more appropriate,
to whatever they like. |
|
s******y
发帖数: 28562 | 6 In my understanding, the most professional way is to label it with the
exitation wavelength, simply because the excitation is strictly controlled
by the sysytem, but the emission is not. The emission wavelength is mainly
controled by the chromophore whichever you use.
However, for the convenience of most user, the labeling of the channel are
often changed to its target chromophores, for example, DAPI, FITC,and TRITC,
which is also appropriate.
But it is not exactly appropriate to label it as "em |
|
b*****l
发帖数: 9499 | 7 我估计你用的是激光。对于一般的灯，excitation wave lenth 也是一个分布，也就是
说，光源不是单色的。
AF488 被 label 成 FITC channel 啊。一个 channel 被 label 成 FITC，是说用来看
FITC 的，这个应该是业界标准。AF488 就是按照 FITC 的标准设计的。
同意你说的 label 成颜色是不对的。
贴个 cube 的图片，你可以看到 cube 上 label 成 FITC 的的确是用来看 FITC 的。
TRITC,
blue","
most
because
最短
明 |
|
s*****j
发帖数: 6435 | 8 as I know, Nikon, Olympus, Zeiss, Leica all use emission filter color to
label cube.
blue" |
|
m*****u
发帖数: 15526 | 9 use cre reporter mice. Such as YFP, LacZ. |
|
|
a****o
发帖数: 1786 | 11 fold of enrichment is a better measurement than IP efficiency. fold greater
than 4 is a good number.
Low IP efficiency sometimes come from that YFP binds to certain target only
in a fraction of cells.
when
00something |
|
m**********d
发帖数: 137 | 12 用YFP标记了肿瘤细胞，orthopotically transplate到裸鼠腹腔内某器官，用
fluorescence imaging来测量肿瘤生长
想问问版上做过类似实验的前辈，这样的实验有什么技术上的困难，多谢 |
|
s****9
发帖数: 932 | 13 YFP in vivo imaging will be a challenge. Lucifierase will work by using BLI. |
|
L***s
发帖数: 133 | 14 整合位置应该是一样的，只是我的TARGET载体外加了个promoter，本想提高表达，难道
是promoter被silence了？
你说的“现在存在的ROSA-YFP要比ROSA-GFP表达强很多倍，解释的原因很多，很多人同
意就是整合的位点不一样”很有意义，有相关文献出处吗？
谢楼上几位啦 |
|
f***4
发帖数: 886 | 15 不好意思，顾着看八卦了。
现在我手头没有文献，明天我问问别人看看。但是我们的经验就是YFP强的多。
另外Abcam rabbit anti-GFP的抗体最好了。
Aves Labs Inc 的Chick GFP 也不错。 |
|
n********k
发帖数: 2818 | 16 my experience is Cre-GFP fusion is horrible...but when use YFP reporter is
great... |
|
s******y
发帖数: 28562 | 17 antigen retrieval 没有用的，因为估计根本就没有多少表达量。
因为有一次我们生气了，就把组织提出来做WB, 结果只看到了痕量的带。
估计组织上不喜欢GFP. 但是组织貌似对YFP没有问题。
不要问我为什么，我不能代表组织。 |
|
R*9
发帖数: 15 | 18 Recruiment of yfg to pathway B through xxx modification
xxx modification of yfp reveals a novel switch mechanism between pathway A
and B |
|
s******y
发帖数: 28562 | 19
这个不好，因为没有反应出我们做的功能测试。
这个标题还不错，但是我们这篇文章其实并没有强调"switching"，因为我们不想
花一大堆没有什么用的数据去证实那个蛋白被修饰后和pathway A真的没有关了
（验证阴性结果远远比验证阳性结果困难）
改成这样如何？
XXX modification renders a novel function of yfp in pathway B |
|
m*****u
发帖数: 15526 | 20 可以。不过太费劲和花时间。用permeable cre peptide做短平快实验完全没问题。但
最好用cre报告基因比如YFP，好知道作用效率 |
|
|
|
b******s
发帖数: 1089 | 23 只要能表达，理论上应该都可以吧。不过好像half YFP有不同的大小，大部分是从大约
150几个aa处断开，也有从174aa处断开（这种据说效率更好）。不同来源的片段应当检
查一下sequence。
pUC19 |
|
r******y
发帖数: 21907 | 24 我也是怕YFP分开的地方不同，这个不是我经手做的，别人走了转给我的，回头不行
sequence看看，或者继续克隆，前面的人没有克隆出来所以才用两个不同载体做。。 |
|
|
b******s
发帖数: 1089 | 26 如果你使用的是一般的laser scanning confocal的话，根据laser source的不同，有
几种固定波长的laser，可以选择。即使不是正好在所谓的maximum上，前后一定范围内
的也是很好用的。488nm既可以激发GFP，也可以很好的激发YFP。你可以设置搜集的
emission的波长，尤其是有两种颜色的荧光的时候。
mRFP和mCherry等都是从最早的DsRed改造过来的。m代表他们大多是单体（我印象里是
这样的），因为dsRed很容易形成四聚体。但是经过改造之后，excitation和emission
都有所变化。但是基本上580nm/610nm都可以很好用。mCherry荧光强度最高，但是mRFP
也很不错。
怎么查？google就可以了。虽然mRFP有很多突变体，Q66M或者是你的Q66T等，主要是促
进了蛋白折叠成熟，用580nm/610nm应该没问题。 |
|
b******s
发帖数: 1089 | 27 放大后的荧光强度有多高，能很容易与背景相区别？
有没有比较的图片发给我看看？我也遇到很多GFP/YFP没有荧光的情形。
谢谢。 |
|
|
|
l**********1
发帖数: 5204 | 30 just try YFP labeling
paper link:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2889740/pdf/mt201047a.pdf
>besides RT-PCR, is there any dry lab method or database to
strategy |
|
l**********1
发帖数: 5204 | 31 Still you can try HAC Human artificial chromosome not BAC bacterial artificial chromosome
with that mice gene with labeled YFP knock in HAC
then expressed in Human kidney cells.
please refer:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21750534
RE:
>如果你得是一个下游基因，那么多半不表
[回复]
发信人: amysf (kdfa), 信区: Biology
标 题: Re: 请教鼠基因在人细胞的表达
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Feb 9 10:03:15 2012, 美东)
...
My gene is about 2500 aa. I used in kidney cells.
----------- |
|
l**********1
发帖数: 5204 | 32 Oui
Before 3D or 4D 5D ND STED/PALM dream comes Truth,
do not trust those below roughly 180 nm scale GFP/YFP fusion protein microscopy picture.
New Book Chapter 1:
HTTPS://openaccess.leidenuniv.nl/bitstream/handle/1887/17922/vanDriel-H1-
Introduction.pdf?sequence=3
Ps:
Princeton PI Sara said one half month ago:
//www.mitbbs.com/article_t/Biology/31628031.html |
|
M*****n
发帖数: 16729 | 33 GFP antibody should work on YFP |
|
p******d
发帖数: 3737 | 34 我也觉得挺奇怪的，这个YFP应该也蛮多人用的，版上也有人推荐了JL-8，咋我做出来
就都是背景呢，阳性和阴性的没啥差别，就坏死的组织在在那里闪闪发光。 |
|
n***w
发帖数: 2405 | 35 YFP不知道，但是我们用的prefer fixative会kill GFP signal。 |
|
M******s
发帖数: 138 | 36 这个和组织致密度（结缔组织多少），组织含水量，组织脂质体含量都有关系，都是相
对的，并没有一个固定的方法，有时候换一种固定液，就需要过糖了，糖溶液并不是为
了脱水，而是为了改变组织冰点，但同时也会改变组织渗透压，这样化冻时候有些组织
细胞结构就会被破坏，组织结构当然也就被破坏了，直接冻，切片，是因为组织液渗透
压接近生理，当然组织不会被破坏，但缺点是后期染色效果差，你的是gfp or yfp当然
没这个问题。
另外，别人的protocol未必适合你，我能做出来，也许你的组织就不work，所以你要去
试，先用不重要的tissue试一下，然后再用到正式实验里。 |
|
g*********5
发帖数: 2533 | 37 just stain live cells and wavelength outside of GFP, YFP. Thanks. |
|
z********g
发帖数: 48 | 38 咳！看来没人把STED原理讲清楚，我就简单说一下吧。
因为任何可见光发光点都有半波长衍射极限，所以光学分辨的理论极限是可见光下限
400nm的一半。
STED（stimulated emission depletion），中文可译为受激发射损耗。
STED的核心思想是，用一束光斑象面包圈(Donut)的、波长比激发光略长的激光将荧光
分子的受激荧光强制损耗掉。
也就是用Donut laser强行让激发态的电子回到基态(stimulated emission)，这个过程
也会发出荧光，但与正常跃迁的荧光波长不一样，可被过滤。
于是只剩下如一根针似的荧光，在XY平面上的分辨率就大大提高了，据称可以达到50nm
以下，但在Z方向的分辨率仍没有改善。
地狱先生（Stefan W. Hell）在读博的时候狂热于超分辨显微技术，1990年博士毕业之
后在家待业一年，发明了4Pi显微镜。然后大概在93年做第
二个博后时，某天看光学物理书，突发灵感，发明了STED，原理就是利用了光学中的受
激发射跃迁(Stimulated emission)。
荧光分子的标记问题一直存在，但如果不标记就无法看见，TR... 阅读全帖 |
|
z********g
发帖数: 48 | 39 咳！看来没人把STED原理讲清楚，我就简单说一下吧。
因为任何可见光发光点都有半波长衍射极限，所以光学分辨的理论极限是可见光下限
400nm的一半。
STED（stimulated emission depletion），中文可译为受激发射损耗。
STED的核心思想是，用一束光斑象面包圈(Donut)的、波长比激发光略长的激光将荧光
分子的受激荧光强制损耗掉。
也就是用Donut laser强行让激发态的电子回到基态(stimulated emission)，这个过程
也会发出荧光，但与正常跃迁的荧光波长不一样，可被过滤。
于是只剩下如一根针似的荧光，在XY平面上的分辨率就大大提高了，据称可以达到50nm
以下，但在Z方向的分辨率仍没有改善。
地狱先生（Stefan W. Hell）在读博的时候狂热于超分辨显微技术，1990年博士毕业之
后在家待业一年，发明了4Pi显微镜。然后大概在93年做第
二个博后时，某天看光学物理书，突发灵感，发明了STED，原理就是利用了光学中的受
激发射跃迁(Stimulated emission)。
荧光分子的标记问题一直存在，但如果不标记就无法看见，TR... 阅读全帖 |
|
l****o
发帖数: 442 | 40 online搜索了一下，有人说必须要专用滤光片，有人说跟GFP一样直接用蓝光激发就能
看到比GFP弱一些的绿色荧光。
因为本人实验室经费有限，如果就普通倒置荧光显微镜下观察比较方便，不知道可不可
行，恳求做过的网友给予指导。
谢谢 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 41 当然可以啊。能不能看到取决于你的蛋白的表达量。
用蓝光可以激发没有问题 |
|
l**********1
发帖数: 5204 | 42 LD 你误解啦 各自做自己熟悉的那部分吧
看S 2011 paper:
Eden E, Geva-Zatorsky N, Issaeva I, Cohen A, Dekel E, Danon T, Cohen L, Mayo
A, Alon U.
Proteome half-life dynamics in living human cells.
Science. 2011 Feb 11;331(6018):764-
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21233346
1st author/immediate supervisor is 2nd author whom is a PI soon,
of course, last author is their project leader/A super Niu PI
both AU and GZN are 一个理论 一个YFP living cell imaging 实验的
都亲自把控着各自的VITips 吧?
AU是不要去哈佛宁愿在以色列的大牛
而二作马上就是PI喽
Israeli female... 阅读全帖 |
|
f*********6
发帖数: 94 | 43 想immortalize人的原代细胞，用了pBabe-hygro-htert。折腾了有段时间了，却没拿到
cell line.想有个tag会显示转染效率。有lenti的就更好了。请问那位能给我匀一点？
请站内联系。谢了先。 |
|
C*******e
发帖数: 4348 | 44 不太明白你说的是要得到两个蛋白的复合物，一个his-一个GST-
还是说同一个蛋白，一个version是his-，另一个是GST-
如果是前者，不要太贪心
先用比较稀的浓度得到复合物以后再浓缩
不过有的蛋白就是容易在高浓度下析出
碰到了也没办法
可以试着加点glycerol之类的在溶液里看看有没有帮助（从提蛋白开始）
另外你说的GST-tag那个问题
好像不管用什么tag的话多多少少都会有些蛋白“死”在柱子上
因为你有YFP fusion所以很容易看到了
不代表以前你做的蛋白没有“死”在柱子上的
如果你的GST-tag是可以切除的
试试on column digestion |
|
b******s
发帖数: 1089 | 45 我做了好几个不同的tag: YFP，CFP, mcherry等。用histone试全部有荧光，但连其他
蛋白的时候，偶尔有荧光，但很多都没有。蛋白和tag中间隔的是MCS，大约15aa的样子
。我看很多其他的载体还做了专门的亲水linker，是不是加了这样的linker大部分情况
下都好用，还是也要看不同蛋白的特性？ |
|
s******y
发帖数: 28562 | 46 E.coli？ 这个比较麻烦，虽然我没有直接经验，但是在我印象中，很多荧光蛋白的
codon被改过用来适应哺乳动物的表达，所以你可能要把你想用的几个蛋白的codon
检查一下（有专门的网站程序做这个事情的）
至于说颜色嘛，CFP, YFP, CheerryFP 应该就足够可以分开了。
但是最好不要用tdTomato, 因为可能会把蛋白变得太大，细菌表达系统对那么大的蛋白
不是
很适应。 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 47 直接用组织切片看荧光蛋白很难的，因为背景很强。一般都是用荧光蛋白的抗体来
检测，而不是直接看荧光蛋白。 |
|
z****u
发帖数: 1007 | 48 推荐JAX的 ZsGreen flox 和 TdTomato flox. Allen Institute的Hongkui Zeng建的。
都是非常好的fluorescent reporter. 能直接看到荧光。 |
|
m*****u
发帖数: 15526 | 49 是么？我做flow cytometry区别还是很明显的。 |
|
z****u
发帖数: 1007 | 50 flowcytometry敏感得多。
反正到现在为止，除了Hongkui Zeng建的那几个REPORTER,别的没哪个reporter能在我
研究的组织里有足够强的直接荧光。 |
|
