a*****s
发帖数: 131 | 1 Why do some of my Rosa26-loxP-stop-loxP-YFP mice show YFP+ even without Cre
or anything else?? Does anyone have experience with these mice from Jax?
Thanks! |
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f*********0
发帖数: 861 | 2 我以前做的Rosa26细胞也是这样.这个东西有自发的翻转或删除.而且表达率还不低,拿
第一代都那样.所以我对科学真得失去了兴致,某些新的发现,其实都是假阳性导致的,可
笑的是一班"科学巨头"发表后,徒子徒生们就不得不从各个方面进行cover. |
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V*******s
发帖数: 19 | 3 Hi: Anyone here works on ROSA26 construct to make transgenic mice?
Thanks, |
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C********4
发帖数: 308 | 4 一个条件性细胞剔除模式小鼠的诞生 (2013-02-22 18:10:22)转载▼
标签： talen 创业 大鼠基因敲除 基因敲除 杂谈 分类： 个人随笔
对于基因敲除（gene knockout）小鼠大家并不陌生，比如我们想要研究一个基因
在体内的功能，我们就可以把这个基因从小鼠体内敲除掉。而有的时候我们除了关心一
个基因的功能外，还想知道表达这个基因的细胞在体内是干嘛的。比如，我们想知道B
细胞是干什么的，胰岛细胞是干什么的？我们可以从小鼠体内把这些细胞清除掉（也叫
细胞剔除，cell depletion），一看不能产生新抗体了，或是胰岛素没了，血糖升高器
官衰竭了，我们就可以恍然大悟说：“你看，胰岛细胞是产生胰岛素的，B细胞是产生
抗体的”。然后就可以发文章到CNS（Cell, Nature, Science）了。当然这些都被别人
发现过了，是我们没有赶上好时代呀。
那怎样才能在体内把一群细胞清除掉呢？方法可能很多，但也真不多。这里我讲一
个非常简单的方法，就是白喉毒素介导的细胞剔除。白喉毒素（Diphtheria toxin, 简
称DT）大... 阅读全帖 |
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J********3
发帖数: 3151 | 5 这个文章有矛盾哈！
文章第5段有如下内容：“且慢，还不行。因为Rosa26启动子太弱了，即使是用EYFP单
基因，阳性跟阴性也只有不到一个log的区别。把DTR-2A-EGFP放那里，谁知道是不是能
够看到EGFP信号呀。所以我们想可以放一个强启动子，于是我们选择了pCAG启动子，这
家伙不但动力强劲，而且是放哪儿都混不吝。也就是文言文里说的ubiquitous。这样就
开始做一个叫做pCAG-loxP-STOP-loxP-DTR-2A-EGFP的工具鼠。”
说的Rosa26启动子太弱了，所以做了pCAG-loxP-STOP-loxP-DTR-2A-EGFP的工具鼠！
可是第6段如下：
“于是我们把它跟一个免疫细胞特异基因（CD19）的cre小鼠交配，年前得到了一只
CD19Cre/Rosa-iDTRGFP小鼠。”
这一句显示并没有用到动力强劲pCAG-loxP-STOP-loxP-DTR-2A-EGFP的工具鼠，明明是
用的启动子太弱的Rosa26-loxP-STOP-loxP-DTR-2A-EGFP工具鼠，呵呵。
自相矛盾啊！ |
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D*a
发帖数: 6830 | 6 有Rosa26，是一个大家都不知道有什么用的位点，所以往里面加东西，理论上对其他基
因没什么影响
但是GFP的efficiency要先保证，才能保证你的pattern是真正的pattern，这里面有多
少个gfp你才能肉眼可见的问题，有从genomic KO到gfp protein表达的问题，有这个细
胞愿意不愿意gfp在那里呆着的问题
我们用rosa26 LacZ的老鼠，做出来的cre表达time line比直接用pcr晚。 |
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s******r
发帖数: 2876 | 7 会不会Cre从转录到翻译，再到重组lacZ Reporter需要时间。
有Rosa26，是一个大家都不知道有什么用的位点，所以往里面加东西，理论上对其他基
因没什么影响
但是GFP的efficiency要先保证，才能保证你的pattern是真正的pattern，这里面有多
少个gfp你才能肉眼可见的问题，有从genomic KO到gfp protein表达的问题，有这个细
胞愿意不愿意gfp在那里呆着的问题
我们用rosa26 LacZ的老鼠，做出来的cre表达time line比直接用pcr晚。 |
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L***s
发帖数: 133 | 8 做了只转基因小鼠，lox-STOP-lox-gene-EGFP，EGFP是fuse在gene的C末端，target的
位置是ROSA26。
体外细胞试验很好, Cre转染后大量的GFP表达，功能也没问题，该基因不toxic。
好了，小鼠做好后，与Nestin-Cre line 杂交后，兴冲冲做了IHC (rabbit GFP Ab, invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
帮忙分析一下原因
1. Fusion protein的问题？可能是fusion protein 表达量低？或是表达量可能并不那
么低，但在PFA fix时导致fusion protein被mask了，所以IHC看不到，证据是lox/lox
比lox/+的阳性细胞要多些。试了citrate buffer antigen retrieval (pH6, 95C,
15min)， 结果更差，一点阳性细胞也没有了。其他可行的antigen retrieval 方
法？
2. 因为target的位置... 阅读全帖 |
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C***2
发帖数: 62 | 9 说到小鼠的模型，最近的一篇文章在ROSA26位点做了很好的一个构建方案，也可以说
是比较复杂，感兴趣的可以读一读：http://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(13)00023-5， The ROSA26-iPSC Mouse: A Conditional, Inducible, and Exchangeable Resource for Studying Cellular (De)Differentiation。
虽然技术上是集大成，但是重编程的效率没有原来的方法高，也许是在某些特定的
条件下能够比较巧妙地回答一些科学问题，或者模型。
B |
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e*******e
发帖数: 9616 | 10 听说macbook air耗电量低，可以连用１０个小时。
所以想让儿子习惯一下
就象他们游泳前的warmup一样。
他们现在其实也已经开始学人体解剖了，是的，还没到８年纪年级而已。回来还教育我
说我不太可能是红脖子，因为红脖子是啥rosa26啥的阳性，亚洲人好象没有这个基因。
当时就把我给笑得。 我想个他搞些ipad广告上的人体３D互动模拟教学软件啥的，潜意
默化加强他一下。 |
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c********o
发帖数: 135 | 11 即使是一个copy的Cre转基因也应该有control。记得nature发过一篇关于Cre的
toxicity的paper，大致是因为很多转基因的Cre都是很强的promoter驱动的，会影响插
入位点附近的基因表达。所以floxed/floxed并不是floxed/floxed;Cre的最好control
，应该是floxed/wt,Cre。
现在有一些cre是knockin在promoter下游的，至少位置是清楚的。另外一个办法是
knockin在Rosa26的位置。
Homo Cre有phenotype是挺有意思的，原来隔壁实验室就有过，但花了很多时间想搞清
楚插入位点，但最后是不了了之了。 |
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D***y
发帖数: 693 | 12 I used oral gavage (0.8 mg/10g body weight). after 7 days, I can detect it
using rosa26 reporter mice. |
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S******9
发帖数: 2837 | 13 Rosa26 work不等于在你的target上work。
it |
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w*e
发帖数: 740 | 14 其实CAG-CREER或者ROSA26-CREER
就能满足你的要求。
你只需要关注你要的组织就可以了
而且MOSAIC的KO 还能在同一个区域找到INTERNAL CONTROL的细胞 |
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s******y
发帖数: 28562 | 15 我们也有类似经历，不过幸运的是我们转进去的只是一个单独的GFP
reporter, 看不到就拉倒了，反正有其他方法来知道哪个是transgenic老鼠.
我们的感觉是很多转进了老鼠内部的基因会有可能被体内的机构关起来不让
表达，或者表达大大降低。
你的情况，最好是这样：
１。把组织提出来做western blot
2. 用anti-GFP 来加强荧光。
我们一向都用Roche mouse anti-GFP，他家的抗体stock solution稀释得比较高，所以
用的时候不能稀释太多(所以比较不经用），但是特异性比较高。
invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
lox |
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f***4
发帖数: 886 | 16 这个很正常的。
检查一下你的TARGET载体构建和ROSA-YFP是不是一样，就是说整合在ROSA的位点是不是
一样。
现在存在的ROSA-YFP要比ROSA-GFP表达强很多倍，解释的原因很多，很多人同意就是整
合的位点不一样。
invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
lox |
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n********k
发帖数: 2818 | 17 also fusion-GFP sucks most of time...
invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
lox |
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l*********i
发帖数: 332 | 18 how in vitro experiments are done exactly? details.
what kind of cell, what exactly construct have you used?
invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
lox |
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n***w
发帖数: 2405 | 19 我用的这个不是inducible的，是我们这里一个老师的，我当时正在（现在也在）选合
适的pericyte cre line，这个pdgfrb和rosa26 reporter line cross了，我看了一下
目的器官的cre表达。
这个老鼠original是从ralf adams那里过来的。
你的NG2好用吗？
我给你发站内信了。谢谢。 |
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s****9
发帖数: 932 | 20 Just the mice directly from JAX or breeder from your own colony.
If direct from JAX, I would say it is the compensation issue.
Cre |
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m******5
发帖数: 1383 | 21 这个东西一直有改进，比如后来加入了insulator 来防止transcription read through
, 没你说的那么夸张。 |
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h********n
发帖数: 4079 | 22 this is leak, it happens in almost all LoxP-STOP-LoxP system. The stronger
of the promoter it has, the more leak they might have.
transcription machinery is not like 1 or 0, it has some 0.2 or 0.8 status.
Cre |
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m******5
发帖数: 1383 | 23 Promoter本来就是一直开着的，不管是r26还是CAG还是CMV还是whatever being used
in this kind of system
这是transcription read through, 通常是因为loxp stop loxp 中的stop太弱
stronger |
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s****9
发帖数: 932 | 24 My two cents:
How protein can be expressed with a stop code, which cause a frame shift?
For my personal experience, I used Rosa-Stop-YFP mice from JAX and cannot
see any leakage in Cre negative mice in any lymphocyte populations.
It's a transgene and thus it is possible that the insert allele can move and
incorporate into other promote region. In that case, you just need to
refresh your line and get a new breeder from JAX.
stronger |
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m******5
发帖数: 1383 | 25 rosa 是在rosa位点的knock in
and |
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h********n
发帖数: 4079 | 26 再说说我的看法吧.
LoxP-stop-LoxP-geneX system will leak more or less. You did not find
protein expression only means the leakage is too low for your detection.
When a LSL-geneX mouse grows to adult and Cre recombinase is introduced by
adeno or lenti, the "newly" expressed geneX will not be recognized as a
foreign protein by mouse immune system.
and |
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h********n
发帖数: 4079 | 27 I guess stronger promoter will tend to have higher chance of transcription
read through.
But I could be wrong. Correct me with ref. |
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D*a
发帖数: 6830 | 28 看哪个line吧，leak严重么？有的leak对自己的课题也没什么影响，照实写就是了，也
不会因为这个课题就不能做了。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 29 RE LZ
pls refer
PMID 21063464
Liu Y et al.
Tamoxifen-independent recombination in the RIP-CreER mouse. (2010).
PLoS One. 25: e13533.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21063464
>There are at least two possible explanations for
>these discrepancies.
>One possibility is that after many generations
of backcrossing to the C57BL/6 background, the expression of the
randomly integrated RIP-CreER transgene is enhanced, thus
increasing the probability of its nuclear entry, even in tamoxifenuntreated
cel... 阅读全帖 |
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z****u
发帖数: 1007 | 30 我的经验是，cre- ERT绝不是文献里那样说的理想的，depends on tissue type,age,
reporter efficiency. 我用的某个line, 在毛发里就有leakage expression. 在我研
究的组织里没有。 然后如果用很敏感的fluorescent reporter就能看到leakage ,但如
果用rosa26-LacZ reporter就看不到。 |
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l**********k
发帖数: 189 | 32 您是说在Rosa26位置上放CreERT2? 如果是这样的话，虽然可以做Tamoxifen induced
cKO，但就没有tissue specificity了。而且，在有些tissue里可能效率不会很高。 |
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m*p
发帖数: 226 | 34 你用过这个cre line 吗？ 我不清楚这个line 是不是很有效。
我用过 inducible 的Rosa26-Cre， 但是得不到global ko。
有谁用过什么line, 能告知一声吗？
谢谢！ |
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m*p
发帖数: 226 | 35 你用过这个cre line 吗？ 我不清楚这个line 是不是很有效。
我用过 inducible 的Rosa26-Cre， 但是得不到global ko。
有谁用过什么line, 能告知一声吗？
谢谢！ |
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t******k
发帖数: 5617 | 36 We use HPRT-Cre for whole body KO
Some other strain also should be OK like:
ROSA26-Cre
ACTB-Cre
。。。。
If you want to avoid any possible mosaic expression, you should cross the
flox mice with cre mice to generate heterozytous F1. The deletion will also
happened on the sperm and egg of the F1 mice, then you can cross the +/-
mice with +/- mice to get the real global KO mice. |
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l**********8
发帖数: 337 | 37 几个月前我还向老板提议做一个这样的老鼠，连knockin到Rosa26 locus想的都是一样
的，然后做genetic screening... |
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w*e
发帖数: 740 | 38 overexpression does not have to use knockin at ROSA26 locus. Transgenic
approach can achieve higher dosage. |
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l****y
发帖数: 486 | 39 Assume your knock-in here refers to mutating a site at the endogenous locus
(thus over expression-type approach, such as making transgenic mouse from
Rosa26 locus, will not be applied here).
Then the question is: you expect your mutation is a gain-of-function
mutation or loss-of-function mutation.
If your mutation is GOF mutation, it is easy, see Kras V12 KI strategy--
basically insert stopper element LSL before Kras V12 Exon. Note that the
allele LSL Kras V12 (before crossing with Cre) is a nul... 阅读全帖 |
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k********n
发帖数: 756 | 40 Thanks a lot, Lumphy.
The mutant has dominant-negative effects and we would like to make a
inducible KI (so it is GOF) since I am sure homo will die and hetero will no
be able to breed. We would like to have rat line instead mice due to its
larger size for microsurgery on infant animals and better characterized
behavior.
Mutating at the endogenous locus or over-expression at Rosa26 locus will, I
believe, give the same phenotype. Which one is easier, simpler and faster?
Regarding the Kras v12 st... 阅读全帖 |
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l********e
发帖数: 415 | 41 和ROSA26 cross一次不就知道了 ... |
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