s******y
发帖数: 28562 | 1 我们需要在一个器官里在不同时期来KO 一个基因，
不知道有哪个cre line 是比较好用的？
我曾经听说过CreER， 就是那个把cre 和Estrogen receptor fuse在一起的
那个，可是我问了一个做过这个的人。他给了非常糟糕的评价，说是他们
做不出来。
请问大家有没有做过类似的事情？有什么更好的推荐么？或者诱导的时候
有什么要注意的事项？ |
G********e
发帖数: 528 | 2 不清楚tissue specific的cre－er，有挺多paper介绍，但是whole body的是可以work
的，不过我觉得不complete，但是有些phenotype是不需要complete的KO，非要提高KO
效率可以试一下用f/-，我没有试过，或者多打几次TAM，可能更容易变成null。
我对whole body的Cre－er的一个concern是cell autonomous的问题无法address，我认
为要做就要一开始用tissue specific，可以说你要做哪个tissue吗？
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们需要在一个器官里在不同时期来KO 一个基因，
: 不知道有哪个cre line 是比较好用的？
: 我曾经听说过CreER， 就是那个把cre 和Estrogen receptor fuse在一起的
: 那个，可是我问了一个做过这个的人。他给了非常糟糕的评价，说是他们
: 做不出来。
: 请问大家有没有做过类似的事情？有什么更好的推荐么？或者诱导的时候
: 有什么要注意的事项？
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s******y
发帖数: 28562 | 3 嗯，你说的那个f/- 这个方法听起来是不错的点子。
我可以试试，因为我们的杂合体本身是正常的。
具体哪个tissue在这里不好透露，否则老板会以泄密罪处决我的。呵呵。
work
KO
【在 G********e 的大作中提到】
: 不清楚tissue specific的cre－er，有挺多paper介绍，但是whole body的是可以work
: 的，不过我觉得不complete，但是有些phenotype是不需要complete的KO，非要提高KO
: 效率可以试一下用f/-，我没有试过，或者多打几次TAM，可能更容易变成null。
: 我对whole body的Cre－er的一个concern是cell autonomous的问题无法address，我认
: 为要做就要一开始用tissue specific，可以说你要做哪个tissue吗？
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i*****n
发帖数: 53 | 4 tetO-Cre可以吗？然后结合tissue-specific rtTA,这样够保险了，只是麻烦。 |
m******5
发帖数: 1383 | 5 疯了吧，这样他要把三个allele配到一起，一窝里有一只就了不起了，万一挂了，或者
phenotype不够明显要重复
【在 i*****n 的大作中提到】
: tetO-Cre可以吗？然后结合tissue-specific rtTA,这样够保险了，只是麻烦。
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w*e
发帖数: 740 | 6 这么做的PAPER已经越来越多了
听正常的，有时候何之三个ALLELES？
【在 m******5 的大作中提到】
: 疯了吧，这样他要把三个allele配到一起，一窝里有一只就了不起了，万一挂了，或者
: phenotype不够明显要重复
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w*e
发帖数: 740 | 7 其实CAG-CREER或者ROSA26-CREER
就能满足你的要求。
你只需要关注你要的组织就可以了
而且MOSAIC的KO 还能在同一个区域找到INTERNAL CONTROL的细胞
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们需要在一个器官里在不同时期来KO 一个基因，
: 不知道有哪个cre line 是比较好用的？
: 我曾经听说过CreER， 就是那个把cre 和Estrogen receptor fuse在一起的
: 那个，可是我问了一个做过这个的人。他给了非常糟糕的评价，说是他们
: 做不出来。
: 请问大家有没有做过类似的事情？有什么更好的推荐么？或者诱导的时候
: 有什么要注意的事项？
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m******5
发帖数: 1383 | 8 有什么trick可以加大产量么？
【在 w*e 的大作中提到】
: 这么做的PAPER已经越来越多了
: 听正常的，有时候何之三个ALLELES？
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z****u
发帖数: 1007 | 9 ERT2 。。据说比ER 好。更强效，更特异。
tamoxifen induce的问题在于不会彻底，比如K14-Cre ERT2 在身体不同部位皮肤的诱导效
率就不一样。从30%到 60不等。所以这个诱导后更像是生成一个mosaic.当然了，有人要的就是这种mosaic KO效果。反正KO效果是dosage dependant的。另外
tamoxifen有毒性。剂量需要optimize。我目前做的一个Cre-ERT2 就遇到这个麻烦，在E18
.5打标准剂量Tamoxifen后所有embryo都会在出生后一天内死掉。 |
z****u
发帖数: 1007 | 10 要做诱导还可以做doxycyclin诱导tTA或者rtTA啊。
比如这样一个
XXX-rtTA;tetO-Cre；XXXfl/fl
虽然是triple transgenic..但是理论讲，在没有诱导
前是没有phenotype, 完全vital的。所以一旦拿到了triple transgenic strain就可以
拿非诱导的mice来keep line以及generate new pups.效率会高很多。我现在在做的耗子就是triple transgenic.如果算上里面的R26R-LacZ reporter那其实是tetra-transgenic.
生成第一个triple transgnic strain需要大概半年时间。
做CMV-Cre全身诱导的问题一来是缺乏tissue specificity.二来那个未必在全身都会有同样的效率。我记得好像CMV-CreER在liver 和lung的效率就不好。反正实在没法了才来这个。
诱导系统目前就doxycyclin和ERT俩了。Jax lab都有。没事上JaxLab网站浏览他们的各种mouse lines很有意思的。 |
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D***y
发帖数: 693 | 11 我用过两种inducible KO
1. CreERT2 (就是第二代的CreER). Cre driven by tissue specific promoter.
我研究骨头。打了tamoxifen （我用oral gavage)10天后就有phenotype。但是
tamoxifen有些副作用，比如增加bone mass.所以需要optimize dosage.另外我用打了
tamoxifende wt mice 作为control,这样可以排除tamoxifen effect.
2. 我用过Tet-Off system. 需要三只老鼠：tissue specific-tTA; TetO-cre,加上你
的conditional 老鼠。喂老鼠doxycyline-containing water or food 直到你想要表达
基因的时候。
3. Teto-ON system:tissue specific-rtTA; TetO-cre,加上你的conditional 老鼠。
喂老鼠doxycyline-containing water or food to induce gene expression。
我做adult inducible knockout。这3种方法都用过，都work.但是tet-off 有点leak（
我研究的是bone).
另外对于第二和第三种方法，你可以查查jax lab,有些tissue specific-tTA (or rtTA
) 和 TetO-cre 是放在一个BAC transgene 上，这样可以提高得到target 老鼠的比例。
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们需要在一个器官里在不同时期来KO 一个基因，
: 不知道有哪个cre line 是比较好用的？
: 我曾经听说过CreER， 就是那个把cre 和Estrogen receptor fuse在一起的
: 那个，可是我问了一个做过这个的人。他给了非常糟糕的评价，说是他们
: 做不出来。
: 请问大家有没有做过类似的事情？有什么更好的推荐么？或者诱导的时候
: 有什么要注意的事项？
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D*a
发帖数: 6830 | 12 不能一棍子打死，现在同一个promoter-Cre的line有好几个实验室在做，每个实验室又
有好几个line，有一个或者几个line不管用很正常。
我们实验室用的一个cre ERT2就挺好的。我们隔壁实验室的cre用了三个没有一个好用
的。
tamoxifen induce彻底不彻底主要还是看tissu和cre的 line，我们在相关部位的KO达
到90%以上。
选line的关键就是知道自己具体想干什么，多看paper，认真比较不同的line。这最后
一句是老板说的。 |
s******y
发帖数: 28562 | 13 你说的有一定道理。
但是这样在另外一方面会导致每只老鼠之间的状态有很大的variation,
碰到挑剔的审稿者就麻烦了。
【在 w*e 的大作中提到】
: 其实CAG-CREER或者ROSA26-CREER
: 就能满足你的要求。
: 你只需要关注你要的组织就可以了
: 而且MOSAIC的KO 还能在同一个区域找到INTERNAL CONTROL的细胞
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s******y
发帖数: 28562 | 14 是的，tamoxifen 的一个很讨厌的地方就是本身毒性很强，放少了状态不明显
让你没法做统计，放多了就统统都死了让你也没法做统计。
诱导效
人要的就是这种mosaic KO效果。反正KO效果是dosage dependant的。另外
在E18
【在 z****u 的大作中提到】
: ERT2 。。据说比ER 好。更强效，更特异。
: tamoxifen induce的问题在于不会彻底，比如K14-Cre ERT2 在身体不同部位皮肤的诱导效
: 率就不一样。从30%到 60不等。所以这个诱导后更像是生成一个mosaic.当然了，有人要的就是这种mosaic KO效果。反正KO效果是dosage dependant的。另外
: tamoxifen有毒性。剂量需要optimize。我目前做的一个Cre-ERT2 就遇到这个麻烦，在E18
: .5打标准剂量Tamoxifen后所有embryo都会在出生后一天内死掉。
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s******y
发帖数: 28562 | 15 谢谢！
【在 D***y 的大作中提到】
: 我用过两种inducible KO
: 1. CreERT2 (就是第二代的CreER). Cre driven by tissue specific promoter.
: 我研究骨头。打了tamoxifen （我用oral gavage)10天后就有phenotype。但是
: tamoxifen有些副作用，比如增加bone mass.所以需要optimize dosage.另外我用打了
: tamoxifende wt mice 作为control,这样可以排除tamoxifen effect.
: 2. 我用过Tet-Off system. 需要三只老鼠：tissue specific-tTA; TetO-cre,加上你
: 的conditional 老鼠。喂老鼠doxycyline-containing water or food 直到你想要表达
: 基因的时候。
: 3. Teto-ON system:tissue specific-rtTA; TetO-cre,加上你的conditional 老鼠。
: 喂老鼠doxycyline-containing water or food to induce gene expression。
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Z**********g
发帖数: 222 | 16 How about AV or AAV Cre? |
s******y
发帖数: 28562 | 17 病毒很难做到组织性特异啊
【在 Z**********g 的大作中提到】
: How about AV or AAV Cre?
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n***w
发帖数: 2405 | 18 看你用什么组织和什么promoter了吧。
【在 s******y 的大作中提到】
: 病毒很难做到组织性特异啊
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D*a
发帖数: 6830 | 19 特定组织ko和全身ko(或者knock down，或者全身的部分细胞ko), 这个还是不一样的。
很多paper都证明很多变化甚至可以相反。
【在 s******y 的大作中提到】
: 你说的有一定道理。
: 但是这样在另外一方面会导致每只老鼠之间的状态有很大的variation,
: 碰到挑剔的审稿者就麻烦了。
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s******y
发帖数: 28562 | 20 是啊。问题就在于，如果我们把一些比较不吻合的现象推到cre表达不均匀的头上，
审稿者一般都不肯放过我们。
所以在计划试验的时候我必须尽量避免这种现象。
【在 D*a 的大作中提到】
: 特定组织ko和全身ko(或者knock down，或者全身的部分细胞ko), 这个还是不一样的。
: 很多paper都证明很多变化甚至可以相反。
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D*a
发帖数: 6830 | 21 你们要是有目标组织的话还是找组织特异性的吧。我觉得这样phenotype好分析，文章
也好写啊。
你还要做几个时间点啊？用不inducible的cre不行么？其实可以先上这个，做出来之后
如果效果好，可以再找inducible的cre 接着往下做啊。如果用tam诱导的话，摸条件就
要摸一阵子，然后如果你要做好几个age的老鼠，还要挨着试试cre的promoter有没有用
，还要考虑你的tam诱导的ko能不能到tissue的stem cell里面（也就是你的tissue更新
之后会不会KO的细胞被新的没KO的细胞换了。）你还有时间做这么多么？而且你打算要
带老鼠走的话，你还要重新取得那个给你们老鼠的人的许可，重新签协议。。。
【在 s******y 的大作中提到】
: 是啊。问题就在于，如果我们把一些比较不吻合的现象推到cre表达不均匀的头上，
: 审稿者一般都不肯放过我们。
: 所以在计划试验的时候我必须尽量避免这种现象。
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G********e
发帖数: 528 | 22 老鼠实验的variation难道不是经常很大的吗？
是不是大致的phenotypes相似，实验组明显和对照组有区别就可以说明问题了？
【在 s******y 的大作中提到】
: 你说的有一定道理。
: 但是这样在另外一方面会导致每只老鼠之间的状态有很大的variation,
: 碰到挑剔的审稿者就麻烦了。
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G********e
发帖数: 528 | 23 用整体CreER会不会有Cell autonomous的问题
在某个器官看到的问题可能是secondary
比如说肾脏的萎缩，很有可能是心血管系统的问题引起，甚至有可能是胰岛病变引起血
糖异常影响的
不知道这样子做审稿人会不会放过
不知道用整体CreER做成年动物的例子多不多，我比较熟悉的是下面这个。
Cell Stem Cell
Article
Deletion of the Developmentally Essential
Gene ATR in Adult Mice Leads to Age-Related
Phenotypes and Stem Cell Loss
【在 w*e 的大作中提到】
: 其实CAG-CREER或者ROSA26-CREER
: 就能满足你的要求。
: 你只需要关注你要的组织就可以了
: 而且MOSAIC的KO 还能在同一个区域找到INTERNAL CONTROL的细胞
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G********e
发帖数: 528 | 24 请问能否举个例子，这个挺有意思的。
【在 D*a 的大作中提到】
: 特定组织ko和全身ko(或者knock down，或者全身的部分细胞ko), 这个还是不一样的。
: 很多paper都证明很多变化甚至可以相反。
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G********e
发帖数: 528 | 25 那能否请问你是想做adult，还是embryonic stage的？
【在 s******y 的大作中提到】
: 嗯，你说的那个f/- 这个方法听起来是不错的点子。
: 我可以试试，因为我们的杂合体本身是正常的。
: 具体哪个tissue在这里不好透露，否则老板会以泄密罪处决我的。呵呵。
:
: work
: KO
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G********e
发帖数: 528 | 26 你说的这个KO被WT细胞take over的情况，可不可以用多次tam注射来解决，比如一个月
一次？
【在 D*a 的大作中提到】
: 你们要是有目标组织的话还是找组织特异性的吧。我觉得这样phenotype好分析，文章
: 也好写啊。
: 你还要做几个时间点啊？用不inducible的cre不行么？其实可以先上这个，做出来之后
: 如果效果好，可以再找inducible的cre 接着往下做啊。如果用tam诱导的话，摸条件就
: 要摸一阵子，然后如果你要做好几个age的老鼠，还要挨着试试cre的promoter有没有用
: ，还要考虑你的tam诱导的ko能不能到tissue的stem cell里面（也就是你的tissue更新
: 之后会不会KO的细胞被新的没KO的细胞换了。）你还有时间做这么多么？而且你打算要
: 带老鼠走的话，你还要重新取得那个给你们老鼠的人的许可，重新签协议。。。
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s******y
发帖数: 28562 | 27 Adult, adult, adult... 555555
【在 G********e 的大作中提到】
: 那能否请问你是想做adult，还是embryonic stage的？
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D*a
发帖数: 6830 | 28 酱紫呀
那看来也没有别的办法了。。。
【在 s******y 的大作中提到】
: Adult, adult, adult... 555555
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D*a
发帖数: 6830 | 29 那就毒死拉，我们这里注射五天，注射的时候体重就下降，注射完过几天才恢复正常。
我上面说的那个ko的，就是比如很多的hormone，如果敲掉receptor，在全身ko/
knockdown，和在某个外周器官敲，和在brain里面ko，很多phenotype都不一样。具体
到paper我还得找找。
【在 G********e 的大作中提到】
: 你说的这个KO被WT细胞take over的情况，可不可以用多次tam注射来解决，比如一个月
: 一次？
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D*a
发帖数: 6830 | 30 关键是你要不说器官的话这里也没人能给你参考了，不过你都被人肉出来了，估计你说了器官你整个课题就能猜到了呵呵。只有靠你自己搜paper了，像上面那篇有paper搞现象的，这种就比较可信一点。我们也看到过几篇paper用的一个cre有leak的。我们还想跟那个做cre 的要更多的数据，因为我们在做类似的东西，怀疑那些phenotype的来源。人家回信客气了几句就没有下文了。可以理解，呵呵～ |
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k***u
发帖数: 176 | 31 要也没用, 有人是给你不好用line的, 这种东西你要了一般就容易是跟人家直接抢
project的. Tet on off 哪个有case就一个work,反正能confirm,有phenotype就行.
说了器官你整个课题就能猜到了呵呵。只有靠你自己搜paper了，像上面那篇有paper搞
现象的，这种就比较可信一点。我们也看到过几篇paper用的一个cre有leak的。我们还
想跟那个做cre 的要更多的
【在 D*a 的大作中提到】
: 关键是你要不说器官的话这里也没人能给你参考了，不过你都被人肉出来了，估计你说了器官你整个课题就能猜到了呵呵。只有靠你自己搜paper了，像上面那篇有paper搞现象的，这种就比较可信一点。我们也看到过几篇paper用的一个cre有leak的。我们还想跟那个做cre 的要更多的数据，因为我们在做类似的东西，怀疑那些phenotype的来源。人家回信客气了几句就没有下文了。可以理解，呵呵～
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i*****n
发帖数: 53 | 32
什么疯了啊，谁说三只一起做breeding的？
【在 m******5 的大作中提到】
: 疯了吧，这样他要把三个allele配到一起，一窝里有一只就了不起了，万一挂了，或者
: phenotype不够明显要重复
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w*e
发帖数: 740 | 33 在我们的组织里，我发现有VARIATION，但是不是那么大。
而且有很多高质量的JOURNAL，比如SCIENCE， GENE AND DEVELOPMENT，就接受很多类
似的文章
【在 s******y 的大作中提到】
: 你说的有一定道理。
: 但是这样在另外一方面会导致每只老鼠之间的状态有很大的variation,
: 碰到挑剔的审稿者就麻烦了。
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w*e
发帖数: 740 | 34 你说的很有道理
但是
这个要看怎么说了，如果按照这个ARGUE，以前的GERMLINE KO 老鼠的研究统统都要怀疑
【在 G********e 的大作中提到】
: 用整体CreER会不会有Cell autonomous的问题
: 在某个器官看到的问题可能是secondary
: 比如说肾脏的萎缩，很有可能是心血管系统的问题引起，甚至有可能是胰岛病变引起血
: 糖异常影响的
: 不知道这样子做审稿人会不会放过
: 不知道用整体CreER做成年动物的例子多不多，我比较熟悉的是下面这个。
: Cell Stem Cell
: Article
: Deletion of the Developmentally Essential
: Gene ATR in Adult Mice Leads to Age-Related
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D*a
发帖数: 6830 | 35 所以现在大家都玩conditional ko了呀
怀疑
【在 w*e 的大作中提到】
: 你说的很有道理
: 但是
: 这个要看怎么说了，如果按照这个ARGUE，以前的GERMLINE KO 老鼠的研究统统都要怀疑
|
G********e
发帖数: 528 | 36 我干过几次，实验组是几次注射三四个月后陆续死掉了，对照组除了男的睾丸变大，别
的没发现异常。
【在 D*a 的大作中提到】
: 那就毒死拉，我们这里注射五天，注射的时候体重就下降，注射完过几天才恢复正常。
: 我上面说的那个ko的，就是比如很多的hormone，如果敲掉receptor，在全身ko/
: knockdown，和在某个外周器官敲，和在brain里面ko，很多phenotype都不一样。具体
: 到paper我还得找找。
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