|
r***e
发帖数: 2539 | 2 Cellecta有customerized library，以前想让他们把library做在我们自己的lentivect
or上，不过后来没谈成。
他们好像有free的DECIPHER Project，不大清楚怎么搞。
readout. |
|
B******o
发帖数: 496 | 3 这个library是based on pLKO hairpin shRNA。 这种shRNA比较高效。
OpenBiosystem还有另一种miR based shRNA pooled library。不过俺试过的～20
shRNA
clones knockdown效率都很差。但是这个library已经被好几个lab用过了(Gregary
Hannon, Michael Green等).你可以权衡一下,呵呵
Good luck
readout. |
|
d*p
发帖数: 534 | 4 I am using Broad library. There are 3 major problems for all the available
libraries.
1st, huge shRNA variation in pool, which means you are going to lose some
shRNAs due to low signal.
2nd, readout, both microarray and deep sequencing are available, however, if
you can not avoid PCR on the hairpin, you will always have difficulty in
the secondary structure.
3rd, even 5 shRNAs per gene, you will still find a large number of genes
without effective shRNA.
If you only need to find some interesting... 阅读全帖 |
|
s*********y
发帖数: 387 | 5 thanks.
I would say the points of 1 and 3 are really fine if we just want to
identify some targets, instead of a thorough screening.
Can you help explain more on
"2nd, readout, both microarray and deep sequencing are available,
however, if
you can not avoid PCR on the hairpin, you will always have difficulty in
the secondary structure."
you mean the PCR for the hairpin sequence will be difficult?
available
some
however, if
in
genes |
|
d*p
发帖数: 534 | 6 Yes, the hairpin structure interferes PCR and sequencing. So part of the
readout will be biased due to different PCR efficiency. Since you only want
to get some interesting genes, it is still feasible to your purpose. |
|
j*******e
发帖数: 59 | 7 想看一下细胞里PKA的活性，打算选一两个蛋白的磷酸化作为readout。有没有已经广泛
被接受的PKA磷酸化的蛋白？目前我知道的是有VASP，但是貌似这个蛋白不在我的细胞
里表达。别的还有vimentin或者CREB，但是别的kinase也可以磷酸化它们，所以不那么
特异。不知道Glycogen synthase kinase-3beta （p-Ser9）是不是个好的候选呢？多
谢多谢！~ |
|
s******9
发帖数: 283 | 8 问几个问题。好奇yeast display能稳定表达多大的protein？Phage display好像只能
表达不大的peptide。Microfludics做IVC有多成熟？是不是都只有fluorescence
readouts？ |
|
L****S
发帖数: 89 | 9 Thanks for the discussion. I know which papers you are talking about. We
have to think about immunology here.
In the endosomal compartment, for dsRNA, ssRNA, DNA, TLR3/7/9 sense them
accordingly. No big question here.
In the cytosol, dsRNA is a strong "danger" signal showing viral infection
. That's why every cell has PKR, RIG-I/MDA-5, etc. So I speculate, when
liposome delivers ssRNA, RIG-I/MDA-5-mediated cytosolic response dominates
the TLR3 signal, quantitatively or qualitatively.
In the pape... 阅读全帖 |
|
h******y
发帖数: 1374 | 10 就是每个sample有多个readout，如何把它们cluster在一起。
谢谢 |
|
f**u
发帖数: 346 | 11 看了半天原来是要坐in vitro，这样就容易很多了。
我记得二十几年前就有人用nuclear extract来泡合成的oligo，
然后用gel shift作为readout来纯化DNA binding protein了。
困难的是in vivo。
enhancer. |
|
a****l
发帖数: 125 | 12 谢快速回贴，偶可能没说清楚：偶想看蛋白stability 是如何调控的。可以做siRNA or
chemical screen, 但readout 是什么？不能总做western, 太慢了。 |
|
s******s
发帖数: 13035 | 13 guess你想做fusion protein，但是fusion protein实际上保护了蛋白，
做stability分析有缺点。另外，你做transgene那么很多readout都是控制
transgene表达的基因，而不是你要的。
western也可以high throughput, 比如microwestern array
see
slow! |
|
b*****u
发帖数: 75 | 14 In the image, the positively-stained area actually has less cells, thus
doesn't look like a colony. Also as aishang pointed out, the staining
pattern of KI67 is not typical.
For xenograft experiment, tumor size might be a more accurate readout (which
you already have). You can have plot, image of mice with tumor, image of
isolated tumors, western of tumor lysate to confirm the knocking-down. That
is already a bunch of data to show. Ki67 staining might be tricky, due to
highly heterogenous patter... 阅读全帖 |
|
k****o
发帖数: 589 | 15
筛药阶段很多情况下并不能发现是不是会引发疾病B的。
目前筛药assay大部分这几类
kinase/enzymatic activity
cell toxicity/death
cell proliferation
protein-molecule interaction
imaging-based high-content screening
这些assay可以是完全in vitro，也可以是cell-based，然而它们的readout都是一些细
胞或者生化指标，和疾病这个层次还有相当距离。 |
|
a*****x
发帖数: 901 | 16 在readout足够清晰，样本数目足够大的时候，数学当然能说明问题。很多人就是不注
重生物中的数学，所以弄得很含糊又很难重复。
认识的一个大牛以前记录一个电生理的时候发现电流各种时间参数有些不吻合，用数学
模型拟合了以后断定溶液中参杂了微量的一种pore blocker。然后实验室上一个人果然
用了灌流系统后没有洗，残留了blocker在里面。类似的例子很多，Chris Miller也是
根据平衡电位和理论值差了几毫伏推断出clc是载体而非通道。经典遗传学还不是就是
根据概率推导出来的。
楼主给的信息有限，的确无法得到明确的结论。但并不表示根据概率做出一些初步的结
论不重要。 |
|
a*****x
发帖数: 901 | 17 These are technical hurdles, which should be solved by finding better
conditions, readouts, or animal/cellular models, etc. Technology serves for
testing ideas, not the other way round |
|
a*****x
发帖数: 901 | 18 试过，不work。文章里有先permeablize cell的，但觉得动作太大了，会引起很多
artifact，尤其我们要看的readout还很慢。 |
|
u*********1
发帖数: 2518 | 19 By readouts, you mean the genetic variants are more complicated?
ie, other diseases are controled by one or just several genes, while
neurological disease is genetically highly heterogeneous with multiple genes
/noncoding region playing roles in pathogenesis?
neurological |
|
n***w
发帖数: 2405 | 20 额，这一切都在3.5小时发生？
你还是测一下nitrite/nitrate比较靠谱。也许你两种注射方式都抑制了nos，只是程度
不一样导致了你的readout差异。
另外，你这个ip的剂量有依据吗？360ul感觉好多阿。。。
selectin |
|
i***0
发帖数: 160 | 21 To be honest, according to my experiences, the worst reliability of a plate
reader is the absorption assays. I have tried Bradford or OD280, both give
high standard deviation. However, if you just want a guess, try using your
sample at original conc, 1:1 dilution, and 1:4 dilution in triplicate. You'd
better have BSA standards at least 5 concentrations in the same plate in
triplicate. These will give you a relatively reliable readout. OD is linear
at 0.5 to 1, roughly. good luck |
|
l*******e
发帖数: 170 | 22 感谢大家回复出主意。我说说我的看法，一年出3个JBC难度极大，远大于3年一个CNS。
因为JBC的文章还是要creativity/novelty的，只不过creativity/novelty比CNS小，工
作量比NS可不少。Biochemistry级别的可以没有creativity/novelty，只要有readout
类型的数据就行了。前面15楼说的BBRC可以说比JBC差太远了，一年弄3个有可能。一个
JBC文章6个图，每个图4-6个panel，大约32个panel在4个月=16周完成，每周出2个可发
表的panel，怎么可能。 |
|
a*****n
发帖数: 2835 | 23 主要是你已经有四年的积累了，看看有没有没有用上的data能补一下发JBC？
我跟你情况差不多，目前正在准备今年争取发一个JBC再投一个别的，要不一篇CELL找
工作感觉有点难度，回国申请千青也没有把握
readout |
|
c********r
发帖数: 1125 | 24
readout
恩，你得前提是这些JBC之间的图是没有联系的。
诚然，1年完全不相关的3篇JBC是很难的，但是如果是很接近的课题的灌水JBC1年3偏完
全有可能，尤其做磷酸化／pathway的，系统成熟，基本就是拿同样的套路体系，换个
分子／pathway灌水一样的故事，这种的JBC1年3偏是可能。 |
|
G********e
发帖数: 528 | 25 一辈子都搞不出1个CNS。。。
JBC多少都可以
唉
一种是不靠用功的，一种是靠用功的。
readout |
|
c****1
发帖数: 1095 | 26 前一段时间太忙了，没空来看论坛。今天接着讨论下。
我做了time course，从5min到4hr都做了。这些目的基因的induction的曲线变化不明
显。
你说检测histone的修饰，但是，histone的修饰，最终的readout还是gene 表达的变化
。如果现在看不到表达方面的变化，那检测histone有什么意义呢？
neuron |
|
b*****n
发帖数: 1841 | 27 最近培养原代细胞做实验，妈呀，同基因型的小鼠细胞之间的readout能有两倍之差，
这样的数据如果用来说明不同基因型的表型差异，那都是超级significant了。
我就不明白很多文章中的那些数据是否可信了。 |
|
s******c
发帖数: 331 | 28 其实很多做数学或做物理的大家觉得逻辑思维很强，但实际上强的是抽象归纳，具体体
现就是数学和现代物理很多的利用抽象符号进行分析和推理，这当然是很强逻辑思维的
体现，而且也产生了巨大的成就比如物理学的进展，人们可以用抽象数学符号去描述普
遍真实世界的规律。但是，在面对很多现实问题或复杂系统的问题的时候，仅仅抽象归
纳是远远不够的，往往需要的是强大的发散思维的能力以及之后的归纳总结，而发散思
维则是以记忆的东西为基础的。我不能理解为什么大家诟病生物需要记忆，单纯的记忆
显然是没什么太大价值的，但是知识面和记忆力却是分析复杂问题的基础，这不是仅仅
take 1
minute and loop up online可以解决的。
比如你研究细胞的signaling，你的readout是Ca2+，这时如果你仅仅简单的去查什么
signaling events可以影响Ca，那你会陷入一片迷茫，你需要事先有很好的知识积累比
如你的系统有什么东西，之中哪些receptors or channels会起主要作用，他们又可能
受哪些影响，然后你才可能分析你的结果。医生也是一样，不能说病人有什么症状就现
去寻找，... 阅读全帖 |
|
y***i
发帖数: 11639 | 29 这个主意20年前就有了。好几个实验室对着核糖体噼里啪啦的做了N年直到一个邪恶
的结构实验室把核糖体直接结晶了。
根本是个苦力活，要拍不同角度的照片，要做3维组合，机理上我根本想象不出怎么
能和结晶拼结果。我觉得只能在一边捡漏。
a
readout |
|
f*****f
发帖数: 195 | 30 你的luciferase readout 稳定么？至少要保证同种control不同实验数值基本一致，跟
不转sirna 样品相比如何? 假如是跟reporter共转之类的话另说。 |
|
T****i
发帖数: 15191 | 31 混沌理论，分形几何，耗散结构论，都是二战后出现的理论，建立者应该是最高级的。
生物学从博物学开始算，能上第一级的就没几个。
我不认为生物学的最大问题是数据不够。大数据的想法本质上还是插值的想法，适合线
性和简单polynomial问题。而非线性系统想做插值运算，难度很大。 生物系统很可能
是非线性系统很多问题还可能是NP hard 问题。没有好的理论指导，有时都无法分辨那
些是有用的数据那些是噪音，也就不能从数据里得到好的结论。比如癌症领域一大堆
association study，有用的结论没多少。这么多年的omics研究，最成功的也就是
phenotype/genotype correlation一类的，也就是生物体黑箱的两端，中间还得靠一点
一滴做。至于interactome，有很多noise。
把生物体比作黑箱，黑箱两端（gene/allele 和phenotype）好办。中间的某些可以局
部分离的问题，比如信号通路，比如secretory pathway，也可以近似为一环扣一环，
线性的，也还好办。而黑箱中间很多过程（比如大多数miRNA功能，信号通路的整合，
细胞之间的通讯... 阅读全帖 |
|
w*****a
发帖数: 437 | 32 刚接触Lentivirus，啥都不懂，求大拿指点。
是这样，老板想看一个基因A在Smooth muscle cell differentiation里面的作用。手
上有个神经干细胞的cell line，加Tgfb后5-6天会变成SMC。
然后有前人留下来的overexpression A的lentivirus，和knockdown A的ShRNA
lentivirus，冻在-80,都大概有10多管15ml的virus。
老板想用virus overexpress 或 knockdown 基因A, 然后看differentiation pattern
有啥变化。可能用qPCR，RNA-seq啥的做readout。
本来想随便测个titer，把现有的virus加1ml到正differentiate的细胞里面（24 well)
，然后提个RNA就得了。后来一想，问题来了：
1）这神经干细胞特金贵，要特殊的medium养才成，我这virus supernatant加进去搞个
几天，还能活吗？更不提按正常程序differentiate了。那做出来的东西，不是非常的
artificial么？
2)... 阅读全帖 |
|
P*******D
发帖数: 523 | 33 谢谢你的回复。
这些invitrogen卖的probe，我们都研究过，而且我也和invitrogen R&D联系过，
invitrogen他们承认他们的probe都不能在live cell里面定量，所以对我们的probe很
感兴趣。
我先讲一下为什么commercially available的probe不能很好的在live cell里面定量：
1.现在卖的所有的GSH或者thiol probe都是基于不可逆反应的，例如monochlorobimane
。一般按照invitrogen的protocol，加10-20 uM的probe和GSH反应，反应后，产物发出
荧光signal。这里的主要challenge是GSH的浓度非常高，一般是1-10 mM。如果是uM的
probe和mM的GSH反应，如果给足够的反应时间的话，不论你是1 mM GSH，还是10 mM
GSH，所有的probe都会被consume掉，所以得到同样的荧光output。
2. one can argue，如果GSH和probe反应足够慢的话，低浓度的GSH反应就会更慢，高
浓度GSH反应快，这样就能区分出GSH浓度... 阅读全帖 |
|
i*e
发帖数: 352 | 34 没有啥能100%万无一失的，BatchPD那个估计common SNPs都已经考虑了，rare的不清楚
，不过rare的话碰到的概率也小很多。此外individual个体还可能有未知的rare
variants，这个就更控制不了了。
看你之前所说，感觉是用来做validation不是detection的，所以万一有那么几个
readout不一致，换对引物或者用其他方法再验证一下。
我有可能记错，不错homopolymer和repeats在exons没有在3‘或者5’端频繁，有碰到
再分别单个手工设计引物好了。
我自己那个script，主要针对自己的实验目的，是WGS的variant validation，主要是
SNVs和小的Indels，也不单单是exonic，所以大多数面向exons的predesigned primers
就无用了，再说SNPs也没有被先排除。
设计引物的时候，input是VCF，已知的common和rare SNPs （dbSNP142）都有先
flagged，然后primer3的结果只取第一个output，之后in silico PCR再过一次，没过
的重新滚... 阅读全帖 |
|
B***v
发帖数: 113 | 35 我觉得你是对的。我开始也想这么做，花了很多时间研究crispr screening，用什么样
的readout，合作者都找好了，但老板不同意这么搞，所以我现在只能逐个分子摸索着
往前做。不过我这个蛋白进入细胞的途径应该依赖于endocytosis machinery.
子。 |
|
p**t
发帖数: 160 | 36 刚才看了一下science这篇文章正文的4个figures，大概说的就是BIF可以增强adaptive
immunity，readout就是IFNg，CD8+，DC surface，MLR。
CD8+ SIY-specific 2C TCR Tg T cells的反应其实和这个BIF可以不可以引起针对肿瘤
的特异免疫反应无关。 黑色素瘤细胞算抗原性比较强的吧。
这个联合疗法基本上把BIF换个别的和aPD-L1一起可以达到同样的效果的。 |
|
l******8
发帖数: 1691 | 37 in vivo two photon imaging, not really that easy but with some tweaking in
vivo imaging down to dorsal hippocampus has been achieved. By expressing
gCamp or other sensors with various promoters and with careful experimental
design and control, we can already read the activity from specific groups of
neurons that participated in acquiring certain memory traces. Specific and
repeated activation and silencing of these neurons or others have been made
possible by optogenetics, which enables external... 阅读全帖 |
|
l******8
发帖数: 1691 | 38 in vivo two photon imaging, not really that easy but with some tweaking in
vivo imaging down to dorsal hippocampus has been achieved. By expressing
gCamp or other sensors with various promoters and with careful experimental
design and control, we can already read the activity from specific groups of
neurons that participated in acquiring certain memory traces. Specific and
repeated activation and silencing of these neurons or others have been made
possible by optogenetics, which enables external... 阅读全帖 |
|
A**H
发帖数: 4797 | 39 Current glucometers use test strips containing glucose oxidase, an enzyme
that reacts to glucose in the blood droplet, and an interface to an
electrode inside the meter,” explains Michael Strano, the Charles and Hilda
Roddey Associate Professor of Chemical Engineering at MIT. “When the strip
is inserted into the meter, the flux of the glucose reaction generates an
electrical signal,” he says. “The glucometer is calibrated so the number
appearing in its digital readout corresponds to the strength... 阅读全帖 |
|
N******e
发帖数: 56 | 40 对， 你原贴中已经提过dominant negative的可能性了。
基于生长变慢和致瘤能力这两个表型，实在不太好下结论。要是有specific的分子水平
的readout就好一些了。
更有可能像skycolor大侠说的那样，两个机制可能压根儿就不一样。 |
|
j*******u
发帖数: 81 | 41 蛋白相互作用从物理相互作用开始做是南辕北辙
现有功能readout
再回头做相互作用。
有功能没相互作用还能往下做
有相互作用没功能就废了 |
|
发帖数: 1 | 42 湾区一家做癌症检测的创业公司招RA，公司文化透明气氛好，funding 足。需要尽快入
职。有兴趣请把简历发到[email protected]
Your Primary Responsibilities
- Work within team environment to support development, characterization,
and optimization of synthetic biomarkers.
- Work within team environment to support development and optimization of
novel in vitro assays that identify & characterize cancer types.
- Document results and communicate findings internally to team and to
external partners.
Your Required Experience, Knowledge and... 阅读全帖 |
|
t*******h
发帖数: 51 | 43 this sounds correct. BTW, not LOL, should be LOD, limit of detection.
Sensitivity and specificiy have very different defination in othet fields.
especially, you were talking about patients, should check out the exact
definitation in medical statistics. google ROC curve.
In the field of sensor, transducer and signal processing, sensitivity is
defined as the first derivative of the transfer function (output readout vs
input signal). |
|
s*******a
发帖数: 16 | 44 It`s easy, just read the manual. By using the printbuffer command in TSP,
you can get the readout. |
|
u***1
发帖数: 9 | 45 同问。现在在做QWIP的readout IC.现在只有参考那些thesis。 |
|
a*****1
发帖数: 80 | 46 前辈好，本人女生，五月毕业的EEMS Boston University，方向是Hardware IC，在学
校做过15个月的RA，一个Readout IC测试，设计过一个4层测试PCB(100MHz),Xilinx
FPGA编程，dynamic/ functional test. 动手能力很强。RF课上还做过一个1GHz AM
receiver(2层PCB),主要修课的都是Circuit 方向：Analog /Mixed Signal IC design(
ADC/OPMAP/PLL), ASIC design, Digital circuit design, Embedded System design
. semiconductor fabrication也学过，还在cleanroom呆过一学期，反正从Board
level 到Transistor physics Level都学过。
毕业的时候RA那项目给拖得毕业了才找工作。现在做System Test Engineer ，1 yr
contract position还在麻省，上周五公司突然裁掉了两个别组的contractor... 阅读全帖 |
|
a*****1
发帖数: 80 | 47 前辈好，本人女生，五月毕业的EEMS Boston University，方向是Hardware IC，在学
校做过15个月的RA，一个Readout IC测试，设计过一个4层测试PCB(100MHz),Xilinx
FPGA编程，dynamic/ functional test. 动手能力很强。RF课上还做过一个1GHz AM
receiver(2层PCB),主要修课的都是Circuit 方向：Analog /Mixed Signal IC design(
ADC/OPMAP/PLL), ASIC design, Digital circuit design, Embedded System design
. semiconductor fabrication也学过，还在cleanroom呆过一学期，反正从Board
level 到Transistor physics Level都学过。
毕业的时候RA那项目给拖得毕业了才找工作。现在做System Test Engineer ，1 yr
contract position还在麻省，上周五公司突然裁掉了两个别组的contractor... 阅读全帖 |
|
m****n
发帖数: 322 | 48 there are two parts, 41 cases ---case management readout materials, and 52
cases---interactive CCS software....which one to start is better?
Thanks! |
|
u***5
发帖数: 23 | 49 有效使用期至11/2/2011 6:23:39 PM EDT.
包括Case Management Readout Material - 41 cases和Interactive CCS Software -
52 cases.
出价$45. 可通过Paypal支付.有意者请发站内邮箱联系. |
|
c******k
发帖数: 252 | 50 三月底考的,今天才拿到的成绩.很高兴过了(汗一个), 俺的追求是通过就好. 分数没有
达到平均值(221),呵呵. 我在考前看了这里很多的考经,所以现在也把经历分享在这里,
希望能够对以后要考试的人有所帮助.
前人的step3考经写得都很好,其中EMMA和watermelonxu的考经尤其有参考价值, 强烈推
荐. ccs online的interactive cases象EMMA说的要练3-4遍为好. 有喜欢研究细节的和
做过内科OB的study partner一起过一遍UW的case很有帮助.UW有大概41个readout
case, cover了一些interactive cases里面没有的内容.
我的timeline:
1月初买了三个月的ccs和uw bank,之前有看88 cases offline, 其实什么都没有看进去
, 还是买了online的题库以后有些动力. 因为只买了三个月的,得争取在题库过期前考
完.
大概一个月做完了一遍,正确率只有58%. 之后重做错题.
2月底做的CD,正确率73%.
3月初做的NBME test2 online, 430.
3月中旬做... 阅读全帖 |
|
