c**i
发帖数: 6973 | 1 row (n; origin unknown): "a noisy disturbance or quarrel"
www.m-w.com
Pay attention to its pronunciation, which is rhymed with cow.
(1) An overview.
HTC's patent trouble; Android Alert | Using Google’s Android software has
given HTC a boost, but it may now make the Taiwanese handset-maker
vulnerable to costly lawsuits. Economist, July 21, 2011.
http://www.economist.com/node/18988966
("The outcome of these cases [which Apple initiated] will be of keen
interest not just for HTC but for other han... 阅读全帖 |
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m**i
发帖数: 47 | 3 多谢指教!!因为PCR product之后要做digestion和ligation, 那PCR clean up如果用
kit的话也要好几百个了吧.还是用phenol/chloroform去protein,或者还有什么更方便
快捷的办法去掉taq和dNTP呢? |
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a***e
发帖数: 1010 | 4 for Taq and dNTP, phenol/chloroform is enough. Problem here is your primers
. |
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C****7
发帖数: 270 | 5 我想卖的物品:
Bovine Pit. Extract (BPE)
Anastrozole
Charcoal/Dextran Treated Fetal Bovine Serum
Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (4.5 g⁄L D-
glucose)
RPMI Medium 1640 (1X), liquid.Contains L-glutamine, but no phenol red.
GAPDH siRNA
X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent
Opti-MEM® I Reduced-Serum Medium
可接受价格(必须明码标价！):
Up to 60% off original price
物品新旧要求:
邮寄方式要求:
You chose you pay
买卖双方谁承担邮寄损失(Required if not code only):
Before mail on me
After mail on you
付款方式说明: |
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m**i
发帖数: 47 | 6 我不太清楚ethanol precipitation的浓度下限是多少，DNA 2.5ng/ul会不会too
diluted了?
而且我有好几个liter, 用phenol+etonol precipitation就不得不把溶液分成很多瓶，
感觉会很麻烦。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 7 有没有遇到过过后即使做了etoh precipitation，OD curve还是不正常的情况？
我遇到过好几次A260 peak shift到 270了，对下游的实验ms也有影响。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 8 多谢啦！你干脆到我们lab来做吧，我们一帮土人每天自己瞎折腾，郁闷啊~
我用PLG column，还以为可以省了氯仿这一步呢，被欺骗了。。。你说95％ vs 100
％是指沉淀那一步？不太明白为什么会有区别。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 10 回了。
其实你也是被我忽悠住了，我们实验室也是一帮土人在瞎折腾。都是半路出家的，拿两
篇paper大家学习一下就开做了，走了不少弯路。。。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 11 呵呵，搭平台确实很痛苦。最恶心的是前面的人没好好搭，随便搞点数据发了
paper，然后老板就觉得我们技术很nb了，对后面的人再做optimization就
很不爽。郁闷啊~ |
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T**********t
发帖数: 1604 | 12 偷偷的说一句，我想换方向就是对Aptamer这东西有点儿小失望，等它做到antibody这
么成熟的程度，我怕我就成炮灰了。当然，我是悲观了一点。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 13 nod，我进lab之后也经过一阵郁闷期，后来想通了：比aptamer更忽悠的东西多了去了，
加上现在好歹aptamer专利快过期＋借siRNA的东风RNA的PKPD study会越来越多，RNA
chemistry会越来越成熟廉价，现在逢低买入，观望个一两年，实在不行尽早止损~ |
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T**********t
发帖数: 1604 | 14 赞逢低买入。:D 向你学习！
洗洗睡了，我这都快天亮了。
了， |
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w******e
发帖数: 1187 | 15 常用的kit对small size RNA/DNA太差，不知道做aptamer/siRNA/micro RNA的铜锈们
都用什么kit做RNA extraction？还是基本都trizol＋phenol＋ethanol，不用
column？ |
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w******e
发帖数: 1187 | 16 取mouse blood低速离心取plasma，volume只占不到一半，这个正常吗？
另外，我想测的是RNA aptamer在blood里的half life，用plasma靠谱吗？就是
说里面RNAse够多吗？
再另外，有人用plasma不加phenol/ethanol直接做过RT吗？我把plasma dilute
50X后加1ul到20ul RT reaction里，用qPCR定量，跟positive control差不多。
还试了多往RT reaction里加plasma，也没影响@@也不知道是否正常呵呵
第一次做，请大家多指点。//bow |
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T**********t
发帖数: 1604 | 17 别的我不知道。
不过ethanol precipitation的recovery其实在室温下比在低温下更好。温度越低，
recovery越差。很多protocol建议低温，其实是出于degradation的考虑。有可能这个
trizol kit里加了很多酶抑制剂，所以不怕degradation，就可以室温操作了。
isopropanol的沉淀效率比ethanol高，所以需要的用量比ethanol少，适合用于浓度比
较低的核酸沉淀。但是isopropanol比ethanol难挥发，真空干燥用的时间更长，得到的
pellet也不如ethanol precipitation的pellet贴壁贴得牢。
至于你的chloroform wash不够effective的问题，也有可能是你吸取aqueous phase的
时候太贪心，想尽量把上层吸干净，结果反而夹带了一点phenol进来。我经常犯这种错
误，最后不得不再做一次chloroform wash，得不偿失。。。 |
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y****m
发帖数: 37 | 18 I recommend you to read Cold Spring Harb Protocol by Rio DC, Ares M Jr,
Hannon GJ, Nilsen TW.
1. less volumn required
2. after isopropanol precipitation, there are normally still lots of crap in
sample. I normally use water plus 0.25% SDS to dissolve pellet, then phenol
extract again, Ethenal precipitate the sample.
3. completely dried RNA is normally very hard to disovle, try to avoid that.
4. after sanp freeze, before thraw in trizol, you could grind it with liquid
N2 first, then disolve with |
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p****y
发帖数: 23737 | 19 Recently, there has been a renewed interest in vegetarian diets. Today there
are countless books, cookbooks, and magazine articles promoting vegetarian
diets and providing guidance for those who wish to follow a meatless diet. A
Short Historical Perspective on Vegetarian Diets
In the past, many viewed vegetarianism as strange and faddish but
appropriately planned vegetarian diets are now recognized by many, including
the American Dietetic Association, as being nutritionally adequate, and
providi... 阅读全帖 |
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w******e
发帖数: 1187 | 20
this should be an easier problem to solve bah? DNAse+acid phenol, repeat
a few times? |
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b*********l
发帖数: 490 | 21 Anybody has experience with an RNA purification kit(Phenol and Chloriform
free)? I only found one from Norgen? Anybody knows if it's reliable?
Thanks a lot. |
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C*******e
发帖数: 4348 | 22 这种kit太多了吧
现在几乎每个生产试剂盒的公司都有
被广泛使用的一个是qiagen的RNAeasy
还有就是Ambion的kit了
不过要看你材料是什么
有的东西其实还是phenol chloriform的效果好 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 23 有的东西用kit做效果不好
结果还是要用trizol
trizol其实也就是加了别的东西的phenol |
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p****y
发帖数: 95 | 24 PEI Transfection
Transfection:
1. Split 293T cells one day before transfection in DMEM/10% FBS medium:
a. 6 well dish: 0.5x106 cells
b. 10cm dish: 4.0x106 cells
c. 15cm dish: 9.0x106 cells
2. Prior to transfection bring all reagents to room temperature.
3. In a sterile tube dilute total plasmid DNA (ug) in serum-free DMEM w/o
phenol red (volume of media is 10% of final volume in culture vessel). Use
transgene: viral packaging (psPAX2):viral envelope (pMD2G) constructs at 4:2
a.... 阅读全帖 |
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s******s
发帖数: 13035 | 25 什么叫做chromosome应该没有问题？phenol再抽一遍再切看看
200ng/ |
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g*******f
发帖数: 427 | 26 1. 关于DNA extract 我以前用QIAGEN的柱子，方便到是方便，可是费钱不说，产量还
很低。后来我一直用 phenol: chloroform，挺好用，最后一步加glycogen 和乙醇后
-20 过夜或者 -80度 1小时，离心后可以看到大砣的沉淀。
2. 关于input，1%的 lysate 可以提取很多的DNA，足够后面PCR 用了。我觉得
normalize to GAPDH 从理论上讲就错了 |
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a***y
发帖数: 19743 | 27 和TRIzol比如何？
Promega这个kit可以用vaccum，column based
而且提取过程就基本彻底去除genomic DNA，不需要用phenol之类的有机溶剂，感觉可
能不仅提取速度快一些，而且少一些有毒有机溶剂，还不需要担心DNAse处理可能带来
的降解和其他问题，也同时减少了DNAse处理所需时间。
据说quality差不多，但是不知道产量如何。一般说column based的产量都要小一点。
但是如果能够达到比如80-90% TRIzol based protocol的产量，我觉得就很好了，毕竟
DNAse处理的时候还要丢失一些。
有人用过Promega这个Kit的人能分享一下经验吗？
谢谢！ |
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y**********o
发帖数: 37 | 28 我们的老鼠做genotyping时用的genomic DNA经过phenol-chloroform纯化后260/280
ratio都是1.4-1.5,根本不影响PCR. |
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w******e
发帖数: 1187 | 29 RNA: in vitro transcription＋phenol＋Urea PAGE purification＋elutrap＋
column desalt。
radiolabeling：artarctic phosphatase，heat inactivate。PNK＋P32 ATP，
heat inactivate。column purify+desalt
thx! |
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w******e
发帖数: 1187 | 30 明白了。好奇问一下，如果xcription时就加radio的话，你们接下来的
phenol/PAGE/elute都在radio room里做吗？感觉确实有点吓人呵呵。
不过这样每个xcript有多个radio label，intensity一定够了：）
遗憾我要用2'-F pyrimidine，只能用epicenture的kit。还是要多谢推荐！ |
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h**********r
发帖数: 671 | 31 同上另外一种方法。
Yeast “smash-and-grab” DNA prep:
• pipette 1-2 ml YPD onto transformation plate; scrape colonies off
with the end of a glass slide and pipette into a microfuge tube
• spin down 15 sec; pipette off sup; if cell pellet is more than 50-75
μl, remove excess and discard
• to cell pellet add 0.2 ml lysis buffer, 0.2 ml phenol/CHCl3 and 0.3
g 0.45-0.5 mm glass beads* (I use calibrated scoop made from cut microfuge
tube pierced with syringe needle) – seal carefully because be... 阅读全帖 |
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s******s
发帖数: 13035 | 32 最近用Roche的Nick Translation Mix碰到问题了。我原来中抽的质粒
没问题，rxn完了大小大概200－400Nts。最近抽的同一个质粒酶切看起来
正常，一做Nick Translation就切碎了，小于100 Nts. 换了几种质粒kit,
用了DH5a, TOP10, Stbl3，都不行，但是control质粒正常。我怀疑质粒
不干净，所以用Phenol抽过，还是不行。请问大家有什么建议？ |
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s******r
发帖数: 2876 | 33 Phenol contamination?
正在做一个TF的chip
用的dynal beads
产物沉淀后（看不见沉淀，只是小心地避开估计有沉淀的区域），用水溶解，用
nanodrop一测浓度达到260ng/ulX60ul, 非常奇怪，首先，一般最后不可能收到这么多
DNA，其次，如果真的收到了这么多DNA，那一般就能看见沉淀了（9ug的DNA必然是能看
见的……）
另外，补充一下，用同一个抗体的目的基因knock out细胞系也能测出这么多DNA |
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l*****a
发帖数: 1431 | 34 QIAGEN 有从血里提DNA的kit。最便宜的就是Phenol–chloroform extraction。
不明白为什么要用trizol。 |
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g*******f
发帖数: 427 | 35 我估计你是sonication 后直接拿来跑胶的。你得完全按照ChIP的样品处理方法reverse
crosslink 后用 phenol chloroform 纯化DNA 后再跑胶，你就会看到富集的小片段了
，而不是smear |
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j****t
发帖数: 1663 | 36 我是在这个lysis buffer里作sonication的。我现在用0.2% sarkosyl（instead of 0.
5%）,和 1% of Na-deoxycholate。sonication的效果很好。而且这个浓度的detegent
对于IP 来说还是高了些，我会在做IP前把sample稀释一倍。
我觉得你的lysis和sonication 的条件也许可以了，问题说不定是在reverse-
crosslink。我的快速检测片段大小和ChIP DNA浓度的步骤如下，供你参考参考。
Check chromatin size and conc.
1. Dilute 50 ul chromatin extracts with 50 ul TE buffer. Add 4 ul of 5 M
NaCl and 1 ul of 10 mg/ml Proteinase K (Invitrogen #25530-015) (use a PCR
tube).
2. Incubate at 65 oC for at lease 4 hr (using a PCR machine) ... 阅读全帖 |
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m*******m
发帖数: 127 | 37 我用phenol／chloroform提取时也常有这个问题，最后发现两相分离时要格外小心，离
心两次就好了。
用RNeasy倒是没这个问题，不过我第二次洗离心后转移到干的collection tube里，再
离心至少两分钟，如果是Nano column的话离心5分钟。 |
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i****t
发帖数: 58 | 38 今天提取RNA,方法是先trizol碾磨保存样品（取样品要用很长时间，不能马上提取），
然后解冻加chloroform（200ul/1ml Trizol）离心取上清液,再直接用RNeasy kit提取
（就是先ethanol再...）。得到的RNA，260/280很好，但260/230较低。大家能否给点
建议，能怎样纯化一下，得到的RNA量较低（35ng/ul for 25 ul）？RNA是用来做qPCR
的，担心是不是phenol而影响酶活性。谢谢 |
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h*******m
发帖数: 19 | 39 注射斑马鱼单细胞的时候，经常用phenol red |
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i*****g
发帖数: 11893 | 40 这种实验室的事情多得是
曾经，液氮冻过，冻疮了，Phenol chloroform，UV 照射到脸上脱皮
被老鼠咬，
还有饥饿到飘飘感觉，浑身冒汗（多年以后，偶然听医生闲聊，说那个叫低血糖症状） |
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b******r
发帖数: 111 | 41 These days, almost make me desperate to death. As a 2-year post-doc,who did
lots of cloning, I fail to do such an easy work. Isolate mouse genomic DNA
by phenol/chloroform,75%ethanol precipitation. Then digest by HindIII
restriction enzyme as follows:
genomic DNA: 2 ug,1ug,and 0.4ug;
HindIII enzyme: 70 units(3.5ul,and different units);
Buffer: 5 ul
add water to 50ul
37 degree for 10 hours. Run gel.Genomic DNA is still a strong band, not
smear at all. I have try HindIII from NEB and Roche com... 阅读全帖 |
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s******s
发帖数: 13035 | 42 你试一下column based的方法抽gDNA吧。我怀疑是不是蛋白没除尽，或者
有phenol残余。
did
not |
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g*****n
发帖数: 250 | 43 有phenol残余的可能性大。用chloroform 再洗一次，再沉淀。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 44 RE LZ:
pls try
Cassette-ligation downstream 3'RACE PCR
or Tail-PCR
Protocol:
看图说话
>
Amplification of FSTs by 3’-RACE
Total RNA was isolated using hot-phenol extraction
[27], from 20 ml cultures in 50 ml Falcon tubes on a rotating
wheel. Reverse transcription used the SuperScript
III First-Strand kit from Invitrogen in a DNA Engine
PCR machine (MJ research). Primer QT was mixed with
5 μg RNA, incubated at 65 °C for 5 min then cooled to
55 °C over 100 sec, after which the annealed mixture
was kept... 阅读全帖 |
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b******r
发帖数: 111 | 45 Thank for the message of you both.
"你怎么抽DNA的，测纯度没有，浓度怎么测的"
-->lysis buffer containing proteinase K digests mouse tail overnight at 65
degree. Phenol/chloroform isolates, ethanol precipitate. Dissolve in TE
buffer(pH7.5). 280/260 ratio=1.7-1.9, 浓度=0.2-0.5ng/uL
I tested 7 forward primers x 15 reverse primers. The totally primer pairs
are 105. All works well to PCR 1fg of plasmid which contain target gene, but
always don't work when template contains both 1fg of plasmid and 0.1ng of
mouse genomic ... 阅读全帖 |
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g*****n
发帖数: 250 | 46 It turns out as I suspected that something inhibited your enzyme. It is
phenol. You don't need to purify genomic DNA for genotyping. You can just
simply heat up your tail preps to 96oC for 10 min to kill proteinase and
take a bit from the preps for PCR. |
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s******s
发帖数: 13035 | 47 你phenol抽一下。
btw，还有个可能是你的质粒复制的时候喜欢环套环，变成二聚三聚一类的，
所以看着大了 |
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g*****n
发帖数: 250 | 48 many ways: e.g., phenol, acetone. |
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M********r
发帖数: 142 | 50 pls refer http://www.nature.com/ncb/journal/v15/n4/full/ncb2702.html?WT.ec_id=NCB-201304
most important is ab.
Yi Zhang used F7452 sigma. nobody won't trust yi zhang ..
ChIP-seq sample preparation.
For Kdm2b ChIP, Kdm2b Flag-tag knock-in mESCs were fixed with 2 mM
ethylene glycol bis(succinimidylsuccinate) (Thermo Scientific) for 1 h
, followed by 10 min in 1% formaldehyde and 5 min in 0.125
;M glycine to sequence the reaction. Cells were lysed in 1% SDS, 10 ... 阅读全帖 |
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