O******e
发帖数: 4845 | 1 ☆─────────────────────────────────────☆
icepiao (icepiao) 于 (Sun Sep 17 00:44:40 2006) 提到:
我转染后利用Anti-V5-FITC进行荧光染色，买的是invitrogen的抗体，目的是看
plasmid transfection后一个protein的表达情况，V5是该蛋白的Fusion protein tag
，因此只要该protein表达，理论上V5应该也表达，基因的启动子是CMV启动子。
步骤为首先co-transfection，利用另外一个report plasmid看transfection
efficiency, 48小时后PBS洗两遍，利用100%甲醇固定5min,然后PBS洗5遍，2min每次，
加入含10%胎牛血清的PBS Block20分钟，然后加入荧光抗体，置暗处1h,然后荧光显微
镜下观察，但是在荧光显微镜下几乎什么也看不到，偶尔有几个有可能有荧光的细胞，
但是太少了。
随后我也采用了4% PFA fix 0.1%Triton x-100 permeabilize, |
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c****l
发帖数: 1086 | 2 http://www.leica-microsystems.com/products/novocastra-reagents/primary-antibodies
Look up here. I cannot remember which one exactly
but we use Rabbit polyclonal anti-Ki67, I think they probably have only one
Rabbit.I can have a look tomorrow and let you know.
Regular IHC protocol,
Mouse brain, 4%PFA fixation O/N
5um paraffin section (or 12um Cryosection)
deparaffination
ph 6.0 Citric acid antigen retrieval 100c 10 min
1 ab 4c O/N
2 ab Rm 1-2hrs
any question, let me know |
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n********k
发帖数: 2818 | 3 Second this one...it is your right to say No and voice your concern...but
P32 indeed post minimum harm to
your pregnancy...many school now don't even mandatory badge/ring for
radiative work. For pregnant lady, it
is advised to have those and it is an optional program whether you want to
opt out from doing radiative work. I
think this kind of policy says a lot about the real/potential danger of
radioactive...the fact is lots of lab
chemicals are way more dangerous than P32, for example: PFA, EB.. |
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h****g
发帖数: 439 | 4 Really?
how about PFA?
and do you think I need keep the tissue from light when the tissue is cut
and fixed? Thanks, |
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s******y
发帖数: 28562 | 5 当然是避光比较好。但是其实也没有那么敏感啦！我们平时做抗体的时候只要不对着强
光就没有事。
你用的是Dextran, 应该更加没有事。
PFA应该可以，只要不会破坏细胞膜结构的都可以（不要加detergent!) |
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h*****o
发帖数: 342 | 6 我一直都用4%的pfa固定组织，fitc-dextran的荧光保存很好
没试过acetone |
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i*********0
发帖数: 915 | 7 不知道怎么回事？
我一般是4%PFA fix 24小时，然后转到30%的蔗糖溶液（in 1xpbs），等到组织沉到底
部的时候的时候，直接取出组织然后用freezing medium包埋，然后用液氮snap freeze。
可是每次在切的时候，都能看到组织有小的裂痕，切的时候很讨厌。
大家觉得我的问题可能存在哪儿？
有没有什么好的方式去做cyro的包埋。 |
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g***y
发帖数: 201 | 8 Ubiquitin(P4D1) #3936 from cell signaling
works very well on PFA fixed paraffin sections |
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j****g
发帖数: 406 | 9 一般养在P-D-L coated cover slip上，用PBS洗两次，用4%PFA fix for 20min.
问题是PBS一洗细胞很容易缩，等到全部staining做完已经没有剩几个了。试过不同的
density好像都有这个问题。想请教一下有没有人有这方面的经验，能拿到如同culture
medium里面同样长得漂亮的细胞，谢谢。 |
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j****g
发帖数: 406 | 10 不知道为什么切下来的脑子的部分都是碎屑．
用的protocol是４％PFA perfusion fix, overnight post-fix at 4C.
70%EtOH x 2, 95%EtOH x 2, Butanol x 3 (several hours, then overnight, then 3
days)
paraffin x 2
固定应该够了，难道是脱水的问题？protocol是实验室以前的，现在没有人做这个．
不知道这儿又没有人经常切能有些经验．谢谢． |
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h****g
发帖数: 439 | 11 这是个困扰我很久的问题。还有，为啥我们用rosa yfp 比较多，为啥不用rosa gfp呢？
还有，为啥rosa rfp 的老鼠能用肉眼看到红色，为啥yfp的小鼠没有颜色呢？
还有，为啥yfp的信号要用PFA固定保存呢？
望达人解惑！ |
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n********k
发帖数: 2818 | 12 Could any friends recommend nice and simply ways to look at mature neuron
dendritic morphology in hippocampus (CA regions and DG as well). my Cre is
so bright and GFP is so weak, hard to tell...not sure whether my sections
still can go for Golgi staining since we perfused with PFA and then sucrose
and then section at 30um...I am thinking to go with calbindin... |
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p***a
发帖数: 6202 | 13 【 以下文字转载自 Tennessee 讨论区 】
发信人: emmaxuxu (Callie妈), 信区: Tennessee
标 题: 乐子来看：生物学研究生的一个梦（zz）
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Aug 12 13:48:36 2010, 美东)
房子不要很大，但是要一个很大的地下室，干什么用，待会儿再说。
大理石地砖，波斯羊毛地毯，法国的桌子，意大利的椅子，此类物品一概杜绝。墙面，
地面，桌面，全采用PFA材料，耐酸耐碱耐高温易清扫，不用担心污渍，脏了，盐酸，
烧碱，双氧水，换着泼，刷完了，用自来水洗15遍，蒸馏水洗5遍，超纯水洗3遍。
（当然是花钱雇人刷，小姐我养细胞刷的瓶子表面积加起来都铺N间房的地板了，看见
国产玻璃细胞培养瓶就感觉吃了一口臭鸭蛋。）
德国schott的试剂瓶，大中小买全套，500mL的拿来喝茶，2L的插花，100mL以下的是佐
料瓶，密封好，定量超准，还耐热冲击（这点是我最欣赏的，非常精准的工艺。国产玻
璃器皿，热冲击很容易就爆裂，拿去灭菌，十个有八个拿出来是碎的。）
玻璃的觉得重，还可以用硅化塑料的，防水不吸附，不用刷子也能洗干净。 |
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n***w
发帖数: 2405 | 14 先saline把血洗了，然后perfuse with pfa。你会很明显地观察到一些特征表明各处基
本都fix了。。。这时候可以停了，取器官。。。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 15 小鼠大脑切片，反正我们做的明显perfusion的比直接扔pfa的好看。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 16 white adipose tissue解剖过一次，现在想看看Brown adipose tissue，谁有protocol
或者图示之类的阿？
还有随后想做IHC，用paraffin包埋的时候有什么注意事项么？这玩意儿粘乎乎的，过
了pfa, ETOH, xylene之后该是什么样的？... |
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p*********g
发帖数: 9527 | 17 【 以下文字转载自 Joke 讨论区 】
发信人: cdlqin (cdlqin), 信区: Joke
标 题: 生物学男的一个梦（转自开心）
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Nov 12 09:00:09 2010, 美东)
房子不要很大，但是要一个很大的地下室，干什么用，待会儿再说。 大理石地砖，波
斯羊毛地毯，法国的桌子，意大利的椅子，此类物品一概杜绝，墙面，地面，桌面，全
采用PFA材料，耐酸耐碱耐高温易清扫，不用担心污渍，脏了，盐酸，烧碱，双氧水，
换着泼，刷完了，用自来水洗15遍，蒸馏水洗5遍，超纯水洗3遍。（当然是花钱雇人刷
，小姐我养细胞刷的瓶子表面积加起来都铺N 间房的地板了，看见国产玻璃细胞培养瓶
就感觉吃了一口臭鸭蛋。）
德国schott的试剂瓶，大中小买全套，500mL的拿来喝茶，2L的插花，100mL
以下的是佐料瓶，密封好，定量超准，还耐热冲击（这点是我最欣赏的，非常精准的工
艺。国产玻璃器皿，热冲击很容易就爆裂，拿去灭菌，十个有八个拿出来是碎的。）玻
璃的觉得重，还可以用硅化塑料的，防水不吸附，不用刷子也能洗干净。
... 阅读全帖 |
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w********r
发帖数: 1431 | 18 小弟最近在做skeletal muscle切片，
肌肉PFA固定/15%蔗糖/30%蔗糖后OCT包埋做冰冻切片，切6-8uM，
切完之后心拔凉拔凉滴，片子支离破碎，
求各位高手指点~~
多谢多谢！ |
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D*a
发帖数: 6830 | 19 PFA固定了为啥还要冷冻阿，直接parafin不就行了？ |
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h****g
发帖数: 439 | 20 PFA固定后，冷冻的时候别用液氮。用干冰会好很多。
当然，这也和组织类型有关系，没切过肌肉 |
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h****g
发帖数: 439 | 21 我的经验是，PFA固定的组织，不能速冻，要干冰慢慢冻
我们都切5um，好好的 |
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x**w
发帖数: 112 | 22 1. try to get some probes as control (ntl, myoD or somehing)
2.fix the embryos with fresh prepare PFA |
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a******n
发帖数: 392 | 23 根据我做了几年的 in situ 的经验，不需要DEPC处理的水，任何一个步骤都不需要。4
％ PFA 固定24小时，样品里的
mRNA不用担心被降解。
been |
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s******r
发帖数: 2876 | 24 那冰冻组织和福尔马林fix的组织，哪一个更适合做in situ，
请问各有什么利弊？
根据我做了几年的 in situ 的经验，不需要DEPC处理的水，任何一个步骤都不需要。4
％ PFA 固定24小时，样品里的
mRNA不用担心被降解。
been |
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g******5
发帖数: 34 | 25
正在做。先用4％ PFA／PBS 室温固定12分钟。再用预冷的甲醇permeabilize (－20C,
10分钟）然后可以block。
另外建议看抗体说明书的要求。 |
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S*****s
发帖数: 287 | 26 Lysotracker 不错，不过只适合做 live cell imaging。用 PFA fix 之后就没信号了
。如果一定要做 fixed cells 的话还是用抗体吧。 |
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s****9
发帖数: 932 | 27 IHC stain一个ER上膜蛋白，自己做的多克隆抗体（rabbit），western效果很好，size
和报道的一直，KO tissue没有带。 但是IHC一直不成功，IHC用的是frozen tissue，
acetone fixation，fast blue development。
想请教:
１。这种ER上的膜蛋白用什么方法fix比较好。我用cold acetone 5min，也试过一次4
％PFA。似乎效果都不好，和KO没有区别。
２。有什么方法可以提高信号强度。有成熟的tyramide protocol可以提供吗? |
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g****0
发帖数: 425 | 28 I had an antibody which could only recognize the PFA fixed sample but not
the one fixed by cold methanol. You may try the trick, but the point is
there may not be "logic"enoughto figure out experimental problems, so don't
limit yourself to any possibility if you really want to push it.
Further, I think you should do IP or westernblotting on native gel to see if
what the antibody recognize. Meanwhile, you can try stain the protein
overexpressed in cell culture.
I know a good antibody can make lif... 阅读全帖 |
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s****9
发帖数: 932 | 29 Thanks. I will have a try of PFA fixation with protein retrieval.
The purpose of the IHC is to in situ visualize the cell type which has the
enzyme expression(located on the ER membrane). My laser capture data
suggests that the enzyme selectively expressed on certain regions but that
regions contains many cell types. IP is not useful for me.
My concern is that the epitope is intramembrane and thus cannot expose out
after fixation.
t
if |
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m**********2
发帖数: 57 | 30 我用humerus section做in situ hybridization的时候,用 RNA hybridization
incubation 过夜70度,发现tissue结构收缩,如附件所示,图示是我已经完成整个in
situ的结果,事实上我在incubation以后就已经发现tissue结构收缩了.
我问了一些人说需要在fixation的时候做decalcification,我做了decalcification,结
果in situ 的时候tissue还是会收缩,事实上看起来更严重.
我不知道这究竟问题出在什么地方,看起来像是tissue attach不牢固,导致容易变形.请
问有什么方法可以使tissue attach牢固么?
我是根据下面的步骤做的:
1. cut the arms and legs
2. 4% PFA (pH 7.1-7.4) overnight at 4C.
3. PBS three times for 5 minutes
4. 14% EDTA for decal 3 days.
5. wash with PBS
6. store in 70% ETO... 阅读全帖 |
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x*****a
发帖数: 972 | 32 fix by 4% PFA
soak in ethanol gradient
snap freeze by liquid nitrogen
sputter coat
imaging |
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m******5
发帖数: 1383 | 33 GFP 不管用甲醇还是PFA固定都不会损失，几乎完全不会损失，你老板想当然 |
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d****7
发帖数: 109 | 34 PFA肯定不会让GFP损失，但是GFP据说不喜欢甲醇 |
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k***5
发帖数: 56 | 35 麻烦大家给一个好的protocol。我们实验室用PFA固定新鲜组织（神经节），然后蔗糖
脱水，组织在20%的蔗糖下沉，但在30%的蔗糖里不沉。三星期后没办法，用OCT和2-
Methylbutane 冰冻包埋。切完发现组织结构破坏，很多的大洞。请帮帮忙！不胜感激
！ |
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L***s
发帖数: 133 | 36 做了只转基因小鼠，lox-STOP-lox-gene-EGFP，EGFP是fuse在gene的C末端，target的
位置是ROSA26。
体外细胞试验很好, Cre转染后大量的GFP表达，功能也没问题，该基因不toxic。
好了，小鼠做好后，与Nestin-Cre line 杂交后，兴冲冲做了IHC (rabbit GFP Ab, invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
帮忙分析一下原因
1. Fusion protein的问题？可能是fusion protein 表达量低？或是表达量可能并不那
么低，但在PFA fix时导致fusion protein被mask了，所以IHC看不到，证据是lox/lox
比lox/+的阳性细胞要多些。试了citrate buffer antigen retrieval (pH6, 95C,
15min)， 结果更差，一点阳性细胞也没有了。其他可行的antigen retrieval 方
法？
2. 因为target的位置... 阅读全帖 |
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M******s
发帖数: 138 | 37 Mouse tissue请问大家一般是先fix，还是先frozen？
看是什么目的用途，传统组织学用途先fix，其他用途例如dna,rna 或不适于fix的组织
学用途先freeze.
一般组织在-80C冰箱能不能长期存放，固定之后冰冻，能不能保质期长一点。
当然能长期放，固定或许保质期会长，但这不是重点，重点还是你的目的和组织的用途
，另外一点一定要注意，fix后的组织要冰冻保存，一定要经过tissue cryoprotection
,传统做法就是糖溶液浸泡。
如果直接冰冻，那些有空腔的组织比如肠子，胃是不是先得灌一些OCT。或者新鲜肠子
能像福尔马林固定那样切开，再卷成卷后冰冻。
都可以，其实因为要切成段再冻到oct里，不必纵向切开，也不必专门去灌，oct自然会
充盈到腔内。
没固定的组织切片一般大家如何固定，固定好的片子能不能长期保存。
关于切片的post-fix，现在用的基本有两类方法，1。 以4%PFA为主的配方，机理大致
是蛋白凝固，优点是固定效果好，缺点是会有交联。
2. 丙酮等有机溶剂浸泡，机理大致是蛋白凝固和脱水，优点组织形态好且无交联，缺
点不能室温长期保存，低温保... 阅读全帖 |
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s******r
发帖数: 2876 | 38 太感谢了。
我就是收集tissue作染色。
如果我没有理解错的话，不固定的组织，就不用泡蔗糖溶液了吧。
要是泡蔗糖溶液，我看一般说是等组织沉到溶液里，这个一般大概会要多长时间。
还有一个肠子的问题，看到有人说肠组织很容易autolysis，我如果想看其中的lacZ的
话，
是不是不固定，不泡蔗糖，直接速冻也没有问题。
Mouse tissue请问大家一般是先fix，还是先frozen？
看是什么目的用途，传统组织学用途先fix，其他用途例如dna,rna 或不适于fix的组织
学用途先freeze.
一般组织在-80C冰箱能不能长期存放，固定之后冰冻，能不能保质期长一点。
当然能长期放，固定或许保质期会长，但这不是重点，重点还是你的目的和组织的用途
，另外一点一定要注意，fix后的组织要冰冻保存，一定要经过tissue cryoprotection
,传统做法就是糖溶液浸泡。
如果直接冰冻，那些有空腔的组织比如肠子，胃是不是先得灌一些OCT。或者新鲜肠子
能像福尔马林固定那样切开，再卷成卷后冰冻。
都可以，其实因为要切成段再冻到oct里，不必纵向切开，也不必专门去灌，oct自然会
充... 阅读全帖 |
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l*****8
发帖数: 22 | 39 (no paraffin)提取RNA的吗？从网上google都是paraffin tissue的方法,我试过Qiagen的
kit,能提到RNA，但是qRT-PCR的结果很差，不知哪位有成功的，请赐教。谢谢 |
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n***w
发帖数: 2405 | 41 这个蛋白有其他的pool吗？ 还是就在膜上？如果是这样，你抗体识别哪个部分？
你怎么处理你样品的？PFA固定还是Methanol? |
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M******s
发帖数: 138 | 42 直接用OCT干冰包埋，差不多-19度切，厚度可以到5-7微米，不行的话15微米也行，air
-dry，4%PFA固定15-30分钟，过水或PBS,水性封片剂或甘油封片，去看荧光 |
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S******9
发帖数: 2837 | 43 我切mouse brain从来就是直接OCT干冰包埋，— 20切，厚度 8微米， air dry，4%
PFA固定 5-10分钟，PBS清洗，然后开始染色 |
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a******s
发帖数: 1088 | 44 如果已经4%PFA perfuse过的tissue不需要在fix了吧
air |
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M******s
发帖数: 138 | 45 谢包子，
关于脱片的问题，很多人都有这个问题，fisher的superfrost一般来讲是没有问题，但
质量不是很稳定，不同批号差异挺大的，有时候会掉得一张不剩，尤其是蓝盒的问题非
常多，白盒的要好一些。我们现在都用自己的产品，基本不会有这种问题 https://www
.hitobiotec.com/product_info.php/hito-super-safe-slide-100-place-
slide-box-p
-50? 如果愿意，你可以试一试。 另外你可以试着切薄片，15微米左右，一般来讲薄片要好一些
关于脂肪滴的问题，以前有人要看脂肪或脂质体，所以脂肪必须留在原位，我给出的
protocol是针对这个目的的，现在想想你不是看脂肪，所以可以换个方法试试。（都是
不固定组织）
方法1
直接用OCT干冰包埋，切片，air dry, xylene 5min, 100% Ethanol 3min x2, 95%
Ethanol 3min x2,70%Ethanol 3min x2,D-water 1min x3,PBS 1min,水性封片剂或
甘油
封片，去看荧光
这个proto... 阅读全帖 |
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n***w
发帖数: 2405 | 46 我的standard protocol是：
1. enucleate the eyes
2. slit the cornea, put the eye in the fixative (usually 4% PFA), for 10min
3. remove cornea and lens and vitreous, and put the eyecup (retina+RPE+
sclera, etc) back to the fixative for about 30-40min. 1hour should also work
.
4. wash with PBS and dissect the retina from the eyecup.
5. put the retina to PBSTriton (1%) permeabilize
6. staining part
这个protocol适用于~95%的蛋白染色。
但是如果遇到一些比较tricky的东西，可能需要调整fixative，固定时间，
permeabilization等等。
我推荐分离之前fix，因为那样的话可以保证... 阅读全帖 |
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h*******o
发帖数: 4884 | 47 嗯,你和我老板刚好相反
她什么都爱用荧光,特别不喜欢DAB.....
40uM肯定可以用的
我们实验室常用的就是40uM,也是PBS 灌流然后4% PFA fix 过夜,
不过是用的冷冻切片
当然10um的切片做出来的IHC/IF要更sharp一点
你先看看二抗是不是用对了 |
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h*******o
发帖数: 4884 | 48 嗯,你和我老板刚好相反
她什么都爱用荧光,特别不喜欢DAB.....
40uM肯定可以用的
我们实验室常用的就是40uM,也是PBS 灌流然后4% PFA fix 过夜,
不过是用的冷冻切片
当然10um的切片做出来的IHC/IF要更sharp一点
你先看看二抗是不是用对了 |
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t**********n
发帖数: 283 | 49 4%PFA overnight/shaking/4 degree
Liver tissue may need further cuts to help infiltration. |
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h*****o
发帖数: 342 | 50 加了glutaraldehyde以后再做免疫荧光什么的效果很差啊，很多抗体都用不了了。一般
的情况只要用PFA (4% paraformaldehyde)就差不多了。除非你对细胞结构要求很高，
要看胞内细胞器或者做电镜的，可以加一点glut。我以前试过加0.1% glut,再往上加抗
体就失效了
.5 |
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