c*********r
发帖数: 1312 | 1 代LP发帖，欢迎交流指教。多谢！^_^
实验中需要标记斑马鱼幼体（D1-D4）的运动神经元，就是通过在肌肉里面的运动神经
元轴突把荧光染料注射进去（retrograde backfilling）。由于注射后的斑马鱼会用于
冰冻切片和免疫染色，同时用的抗体需要先切片然后再快速用甲醛固定，然后还要做免
疫染色，所以一般的dextran或者DiI的染料都不适用，会被洗掉。最后选择了
Invitrogen的CM-DiI，说是可以共价联接在膜蛋白上。
试了CM-DiI，确实不会被洗掉，但出现了几个问题：
1. 注射鱼的时候鱼的组织会被粘在注射用的玻璃针里面，一来会堵玻璃针，二来对鱼
造成的伤害很大。我试过用DMF、酒精以及二者的混合溶液作溶剂，全都有这个问题（
染料浓度是1 mg/ml）。其中用酒精做溶剂造成的存活率相对高一点，所以最后我一直
都用酒精作溶剂。
2. 标记运动神经元的效率下降。以前我用dextran注射的时候，只要注射到轴突支配的
肌肉里面，很容易就标记了运动神经元。现在用CM-DiI，会发现被注射的肌肉部分有很
强的荧光，但却没有进入轴突。貌似需要很精确地注射到轴突里面才行，那个难度就比
较大了。
总之，现在用这个CM-DiI用得非常失败，目前为止还没有一例标记成功。如果有哪位有
用过这个染料或者知道一些经验，还望多多指教。多谢了！ |
h******y
发帖数: 351 | 2 You can try FluoroGold, which is compatible with PFA.
Check out here.
http://www.fluorochrome.com/
【在 c*********r 的大作中提到】
: 代LP发帖，欢迎交流指教。多谢！^_^
: 实验中需要标记斑马鱼幼体（D1-D4）的运动神经元，就是通过在肌肉里面的运动神经
: 元轴突把荧光染料注射进去（retrograde backfilling）。由于注射后的斑马鱼会用于
: 冰冻切片和免疫染色，同时用的抗体需要先切片然后再快速用甲醛固定，然后还要做免
: 疫染色，所以一般的dextran或者DiI的染料都不适用，会被洗掉。最后选择了
: Invitrogen的CM-DiI，说是可以共价联接在膜蛋白上。
: 试了CM-DiI，确实不会被洗掉，但出现了几个问题：
: 1. 注射鱼的时候鱼的组织会被粘在注射用的玻璃针里面，一来会堵玻璃针，二来对鱼
: 造成的伤害很大。我试过用DMF、酒精以及二者的混合溶液作溶剂，全都有这个问题（
: 染料浓度是1 mg/ml）。其中用酒精做溶剂造成的存活率相对高一点，所以最后我一直
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c*********r
发帖数: 1312 | 3 多谢！不过我的问题其实不是是否能够用PFA，dextran、DiI和CM-DiI都有可以用PFA的
种类。但是我的实验中甲醛固定是在切片之后，因为切片时会把切开一部分细胞，而在
甲醛固定之前染料是不会和组织交联的，所以水溶性的染料比如dextran在固定的时候
就被洗掉了。
这个FluoroGold我看了一下也是水溶性的，不知道会不会也有这个问题……
【在 h******y 的大作中提到】
: You can try FluoroGold, which is compatible with PFA.
: Check out here.
: http://www.fluorochrome.com/
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h******y
发帖数: 351 | 4 你可以固定之后再切片吗？
【在 c*********r 的大作中提到】
: 多谢！不过我的问题其实不是是否能够用PFA，dextran、DiI和CM-DiI都有可以用PFA的
: 种类。但是我的实验中甲醛固定是在切片之后，因为切片时会把切开一部分细胞，而在
: 甲醛固定之前染料是不会和组织交联的，所以水溶性的染料比如dextran在固定的时候
: 就被洗掉了。
: 这个FluoroGold我看了一下也是水溶性的，不知道会不会也有这个问题……
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c*********r
发帖数: 1312 | 5 不行，因为目标蛋白需要快速固定。先固定后切片的话目标蛋白就扩散了。所以我是快
速冷冻、快速切片、然后固定染色。。。
【在 h******y 的大作中提到】
: 你可以固定之后再切片吗？
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r******1
发帖数: 20 | 6 楼主的lp搞什么专业啊，居然弄斑马鱼的神经元啊！ |
c*********r
发帖数: 1312 | 7 她做斑马鱼神经发育。^_^
【在 r******1 的大作中提到】
: 楼主的lp搞什么专业啊，居然弄斑马鱼的神经元啊！
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c*********r
发帖数: 1312 | 8 自己顶一下。
我猜想这个和染料以及注射用的needle材料表面的亲水性、疏水性有些关系，但不确定
。现在开始查一下。 |
