C********4
发帖数: 308 | 1 我前四五天做了lentivirus，过表达一个蛋白。当然我按操作规则做了。但是那个P2
lab很脏乱，谁知道别人是不是很小心。
结果这两天出现了流感样症状。是感冒了，还是被lenti感染了？
lenti感染会是啥症状？ |
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d*p
发帖数: 534 | 2 迄今为止，有没有被lentivirus感染的试验人员报道过？ |
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F********1
发帖数: 272 | 3 这两个包装质粒，连同你的pLKO目标质粒，肯定是可以包装出lentivirus的。三者的比
例很重要，293T细胞的状态也非常重要。你的pLKO上有GFP吗？你怎么知道的没产生病
毒？ |
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b********2
发帖数: 4 | 4 朋友刚发现怀孕，可是接下来的试验要做lentivirus,很担心，能做吗？应该注意什么？ |
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h********n
发帖数: 4079 | 5 多戴一层手套就好了.
上周我用lentivirus表达一个很强的oncogene, 结果pippette带着tip一不小心戳在手
上, 不过手套没破, 吓了一跳. |
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p*l
发帖数: 1359 | 6 很多工作，如果操作不当都有危险，这和孕妇不孕妇没啥关系。如果要担心的话，不如
问问自己：1，自己做这类要比较小心实验是不是比较靠谱，2，如果不做，即使能找人
帮忙，肯定会耽误事情的，那么你有没有这个本钱或者能力，或者说你在一个组里的价
值够不够让老板／上司忍耐一阵。
如果做不到1，请赶快改行，如果做不到2，也请考虑改行。所以这个问题，不是
lentivirus孕妇可不可以做的问题，而是问问题的是什么人。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 7 我想了一想，再补充一下吧，
在做lentivirus 的时候一定要做好防护，尤其是要戴护目镜。还有，在收获病毒的时
候有两种方法，一种是用0.4um filter 过滤，但是在做这一步的时候如果不用针头的
话很难把溶液吸到针管里，但是用针头的话则会增加风险。所以我建议采用第二种方法
，那就是低速离心法把细胞碎片和病毒分开，然后直接取上清来用，就行了。
使用过的东西，直接往bioharzard bag 里丢就好了。
么？ |
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d*****n
发帖数: 166 | 8 我也可以举个核电站的例子
就事论事吧，我只不过觉得lentivirus是个有潜在危险的东西，操作安全级别也有要求
，有选择的情况下最好别做。
sunnyday同学知识丰富，我很佩服。他的观点其实和前面一位劝退的仁兄差不多， 大
概就是生物是个苦逼行业，不做这个也会被逼去做哪个。
其实最主要的还是看这个妈妈的老板，其实很多好老板是可以理解的。前面也有人选择
了不做，一点事没有，没有烧断桥，也没有被开除什么的。
我不是做生物的，所以对安全规定比较敏感吧。去的那个合作实验室算是挺好的吧，但
大家的违规操作不要太多。
为这么个事码了这么多字，挺无聊的 |
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m*****z
发帖数: 1451 | 9 做细胞的都是bsl2啊，不是bsl3都还好吧。lentivirus好像是bsl2+ |
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b******s
发帖数: 5365 | 10 过滤病毒可以这么做－－－－－不用针头，直接用注射器吸入悬液，然后拧上0.4 um
的过滤器 过滤。
我博士期间的实验室是专门做病毒的，常规做 lentivirus and other recombinant
virus ，我们一直都是这么做的，从来不用针头。 |
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B****n
发帖数: 22 | 11 lentivirus -80保存了一阵，上周取出来用发现感染效率下降很多。
大家都是怎么保存的呢，
我当时收集了上清直接放在-80冰箱里了，需要用液氮速冻啥的么？ |
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t**********r
发帖数: 145 | 12 老板要我花一段时间做个过程优化, 已经有Lentivirus vector带目标基因来transduce
primary human T cells, 想提高transduction efficiency, 都有哪些过程参数, 如
何优化?
多谢多谢!!! |
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s****9
发帖数: 932 | 14 不知道楼上的两个人怎么回答你的问题的？你的问题这么笼统。
你是想overexpress BM－derived dendritic cell还是splenic dendritic cells，还
是tissue dendritic cells？Human的还是老鼠的？各种感染都有不同的protocol？In
vivo还是In vitro？有的retrovirus效果就非常好，有的lentivirus也很难。
楼上的回复的就随口说说，也不attach文献什么的，不知道楼主获得有用信息没有？
哎。。。。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 15 有没有人做过相关的比较？哪个病毒载体在感染细胞之后表达得比较快，哪个比较慢？
我的印象中好像是Lentivirus最慢，但是我没有看过相关文献不知道是不是对的。
谢谢！ |
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S*********s
发帖数: 304 | 16 用过lenti/retro
感觉表达差不多，基本要2-3天。
lenti titer比较高 > retro.
两者包装的片段大小都有限，<80KD, 再大一点的蛋白对病毒滴度影响很大，一般需要
浓缩。
retro 较 lenti安全一些。包装retro的时候可以选择pCL-Eco, pCL-Ampho,etc等
不同的外壳蛋白。pCL-Eco只能介导感染mouse cell,在做oncongene的时候尤为重要。
你不希望用个EGFR mutant or K-Ras mutant的lentivirus 去感染你的小鼠or细胞，一
旦泄露，有oncogenesis的风险。
另外retro只感染分裂的细胞，生长很慢的细胞用retro感染效率很低。
另外从整合到基因组上的位点来看，lenti有 hotspot，retro更倾向于插入
transcription active的region。所以很多random mutagenesis是retro based的。
Adeno没用过，据说插入基因的size可以更大，但做载体比较麻烦,没经验。 |
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a****d
发帖数: 1919 | 17 个人经验， lentivirus （ubiqutin promoter） 感染的细胞，12小时后可以看到eGFP
表达。 CAG-CMV promoter based lenti也能很快看到外源基因表达。
我培养的原代细胞，D0用lenti处理，D3 固定染色，没有问题。 |
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c**a
发帖数: 94 | 18 想做double infection,细胞已经被murine stem cell virus
感染过来表达蛋白，请问还能再被带shRNA的lentivirus感染吗？
谢谢 |
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n*******l
发帖数: 75 | 19 请教构建lentivirus质粒的大拿，菜鸟求教
我想沉默pc12细胞的一个基因。查到某公司有公布的基因的沉默序列，在pGFP-shlenti
上。我想构建到lvthm上
问题是我们实验室构建的模版都是（21nt+9bp的loop+21nt的反向互补）在lVTHM上。公
司公布的是（29nt+7bp+29nt的反向互补）
。直接把用（29nt+9bp的loop+29nt的反向互
补）可以直接构建到lvthm上 影响沉默效率么，另外，loop的长短会影响沉默效率么。
万分感谢。 |
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C****c
发帖数: 1964 | 20 想让公司做一个lentivirus KD一个基因，哪些公司比较可靠一点？谢谢！ |
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e********c
发帖数: 30 | 21 看很多protocol说制备lentivirus或者retrovirus最好不要用mini-prep的质粒。请问
有人这么用过没？效果如何？ |
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c*****1
发帖数: 22 | 22 请问，实验室用lentivirus载体有多大危害啊？我老板把这个说得很夸张。实验室的病
毒操作感觉没有很规范。因为最近家里有小宝宝了，请问这个会不会万一从实验室带到
家里啊！
对这个很熟的人过来说说看啊！ |
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F******p
发帖数: 2099 | 23 把构建好的lentivirus plasmid拿去测序， 可能序列有了问题。 |
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p****t
发帖数: 18 | 24 请教一下，为什么要用lentivirus？如果只是做过表达细胞系，直接nucleofection然
后再FACS/抗生素筛选不就可以了吗？
sites |
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m****p
发帖数: 122 | 25 最近在做利用lentivirus表达sgRNA KO一个基因，转染第一步就出现问题。
针对两个位点病毒是sigma定制的，寄给我的滴度是5*10^6/ml和1*10^6/ml，我用它们
转了两个细胞（12孔板，每个孔10微升病毒），该病毒正常应该有GFP及puro抗性基因
表达的，我在转染24小时和48小时居然没有看到任何荧光。
我原来用过santa cruze的shRNA病毒，转染后用puromycin筛选，转染效果还是可以的
，最后也筛选出了我要的单克隆细胞。
有人遇到过我现在这个情况吗？怎么解决？
谢啦 |
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b*****n
发帖数: 1841 | 26 想用lentivirus 携带基因感染小鼠组织，未获得成功。有没有有效感染成功的案例？
版上有做这方面的朋友给展开说说。
多谢！ |
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i********d
发帖数: 7 | 27 3T3-L1细胞转了lentivirus，用10ug/ml的Blasticidin筛选，现在9天了，LacZ-
Lentivirus转的细胞死的差不多了，能看见单个clone了，不过我自己做的lentivirus
转的细胞还是很多，下面该怎么办？提高Blasticidin的浓度？
或是我这个基因对细胞有保护作用？多谢指教！ |
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c****y
发帖数: 14 | 28 请教各位大侠：
我想构建一个稳定细胞系，将质粒转染细胞并用抗生素筛选得到抗性12个细胞系，
但是Western blot检测不到蛋白表达。所以我又采用另一种策略构建，先将基因克隆到
Lentivirus vector上，用CMV promoter 启动目标基因表达，这个vector同时有EF1
promoter表达GFP, 重组质粒转染293T 细胞后制备lentivirus, 然后用Lentivirus感染
H1299细胞，再用GFP进行cell sorting得到稳定细胞系，在荧光显微镜下可以看到GFP
信号，所以这些细胞系应该是整合得有我的目标基因，但是，Western blot还是检测不
到蛋白表达。请问这是什么原因？另外，我瞬时转染这些质粒可以检测得到蛋白表达，
说明质粒正确。但为什么稳定细胞系检测不到蛋白表达呢？请问有什么可能的机制？谢
谢帮助！ |
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s******r
发帖数: 2876 | 29 也许你的CMV promoter被甲基化了，换个promoter试试。
请教各位大侠：
我想构建一个稳定细胞系，将质粒转染细胞并用抗生素筛选得到抗性12个细胞系，
但是Western blot检测不到蛋白表达。所以我又采用另一种策略构建，先将基因克隆到
Lentivirus vector上，用CMV promoter 启动目标基因表达，这个vector同时有EF1
promoter表达GFP, 重组质粒转染293T 细胞后制备lentivirus, 然后用Lentivirus感染
H1299细胞，再用GFP进行cell sorting得到稳定细胞系，在荧光显微镜下可以看到GFP
信号，所以这些细胞系应该是整合得有我的目标基因，但是，Western blot还是检测不
到蛋白表达。请问这是什么原因？另外，我瞬时转染这些质粒可以检测得到蛋白表达，
说明质粒正确。但为什么稳定细胞系检测不到蛋白表达呢？请问有什么可能的机制？谢
谢帮助！ |
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m*****y
发帖数: 857 | 30 我自己提供载体，要求把载体里的GFP去掉，换成我提供的蛋白基因，然后包装成
LENTIVIRUS， TITER最好高一点，不过TITER不太重要，可以只做CLONING，然后提供
一点LENTIVIRUS我来检验蛋白表达和活性，然后我去找其他公司去做高产量的
LENTIVIRUS也行。
求推荐！！！//BOW |
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m*******a
发帖数: 79 | 31 用RNAi knockdown了一个gene后，如果需要做rescue，可否用Lentivirus 去
overexpress这个gene？我觉得最好用一个construct同时表达shRNA，和一个RNAi
insensitive variant，但是这个太麻烦了。
想直接从Open Biosystems 买ready-to-use lentivirus with shRNA 和lentivirus
overexpressing the target gene，不知道可行不。 |
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c****1
发帖数: 1095 | 32 以前用CRISPR，都是用在原代细胞上，因为转染效率极低，所以，只有用lentivirus来
做。
先要建立几个KO的stable cell line。首先，不经过仔细思考的办法，就是用
LentiCrispr的慢病毒来做，然后加puro筛选。但是，这个方法不好的地方是，Cas9一
直表达，时间长了，off target肯定会比较多。
后来觉得，用Tet On的promoter来控制Cas9的表达，这样只在短时间内表达，应该会好
很多。
后来再一想，这个gene edit，本来就是permanent的。没必要用lentivirus来，这
lentivirus还会整合到genome里，顺便破坏哪个基因还不晓得。为什么不直接用
transfection呢？唯一可能的问题就是效率可能低了点。还有可能问题的，瞬时
transfection，通常每个细胞的plasmid会很多，这样Cas9的量太高了，会不会又会增
加off target的概率？
大家一般是首选什么策略？ |
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z*****s
发帖数: 289 | 33 发信人: pll (娃娃鱼), 信区: Biology
标 题: Re: 怀孕能做lentivirus吗？
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Apr 8 16:32:23 2013, 美东)
很多工作，如果操作不当都有危险，这和孕妇不孕妇没啥关系。如果要担心的话，不如
问问自己：1，自己做这类要比较小心实验是不是比较靠谱，2，如果不做，即使能找人
帮忙，肯定会耽误事情的，那么你有没有这个本钱或者能力，或者说你在一个组里的价
值够不够让老板／上司忍耐一阵。
如果做不到1，请赶快改行，如果做不到2，也请考虑改行。所以这个问题，不是
lentivirus孕妇可不可以做的问题，而是问问题的是什么人。
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31796109.html |
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g**********2
发帖数: 2408 | 34 不知道你们看的新闻是怎么说的，但我想大概说的是Lentivirus。HIV 属于Lentivirus
的一种，用lenti virus转基因效率非常高。很多基因治疗的临床试验都用到它们。原
因很简单：通过进化，它最拿手的就是将基因转到动物细胞体内。适者生存么。
但是这些virus 已经经过改造，所以并不致病。
打个比方：
有个强盗很会撬锁（侵入细胞），警察学会了他的撬锁技术，但是用来救人。 |
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s********s
发帖数: 84 | 35 顶一下。。。能不能别的东西的经验啊。。
比如produce lentivirus
为啥titer很高，就是不表达目标蛋白啊。。（plasmid是对的。做transfection可以表
达目标蛋白，但是produce lentivirus以后，用virus做infection就检测不到目标蛋白
了。。） 可不可以告诉俺这是为啥啊。。
当然了，这个问题跟LZ分享的东西无关。。不能回答也没关系。。就当我纯抱怨啊T T |
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r******c
发帖数: 98 | 36 本人对stem cell有些兴趣，在此也问几个比较菜的问题
为什么不把fibroblast直接reprogram成neural stem cells呢？neural stem cell 可
以扩增，而且有paper都显示transplant neural stem cells 有一定的改善疾病症状作
用。
还有一个我对iPSCs的疑问，现在好像比较成功的方法还是使用lentivirus来reprogram
(其他的方法有报道，但efficiency很低，没有被各实验室广泛使用)。既然
lentivirus 会随机插入基因组，这样会不会导致产生出来的iPSC cell line各不相同
？说不定有些可以变成neural stem cell, 有些或许分化效率极低或者就压根不能。如
果是这样，那么用这些iPS cell line去model disease 会不会得到一些误导的结论呢
？ |
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p******i
发帖数: 1092 | 37 如果不放心：
带2层手套，穿一次性的LAB COAT，戴N95口罩，戴MASK……
大家用的LENTIVIRUS其实没有HIV恐怖吧……
HIV 是3级LAB了……
LENTIVIRUS的VECTOR，1-2级……
我以前做过一些……开始怕怕，后来就麻木了，汗…… |
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p*****m
发帖数: 7030 | 38 帮老婆问的 请牛人们指点呀
实验是这样的，lp要在BMDC里knock down几个gene，她做了lentivirus/retrovirus里
面带目的基因的shRNAmir，然后她取了小鼠的bone marrow,用病毒侵染，然后加入
GMCSF诱导分化成DC。如果是retrovirus的话是侵染fresh bone marrow （spin
infection）；lentivirus的话是BM分化4-5天后加病毒进去
现在的问题是，不管是哪种virus（包括没有shRNA的control），侵染后看得到GFP+的
细胞证明侵染成功，但是看不到CD11c+的细胞了（如果不加病毒的话，CD11c+分化正常
），调整MOI没有用处。
牛人们帮忙看看这个有什么可能解释 然后有什么解决方法么？看起来似乎病毒本身就
能抑制BMDC分化 可是病毒侵染DC也算是常用方法了 不知道哪里出了问题。。 |
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l*****m
发帖数: 122 | 39 谢谢你的建议:)
具体说说我的virus载体和transduction的过程吧~
1> retrovirus用的是MSCV based带有mir155 backbone的一个载体（某postdoc自己构
建的）有GFP marker。因为它只侵染dividing cell, 所以就在collect BM的当天做一
次spin infection （用fresh virus containing sup from transfected 293T cells)
，之后两天各做一次spin infection，然后让细胞在有GMCSF的medium里面继续分化到
day7 (中间换一次medium). 最后收细胞染色FACS. 现在结果就是no virus control分
化没什么问题，通常我得到90％ CD11c+细胞，其中MHCII+大概15％；问题是无论是
control virus (empty vector)还是有target shRNA的virus，细胞就不表达CD11c了 (
<10%），MHCII到没怎么变，还看过CD86之类的co-stimulatory molecul... 阅读全帖 |
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z*******6
发帖数: 679 | 40 I don't think the selection marker matters a lot. I think it is the cell
line and the way of transfection that matters more. If you don't care the
expression level tooooo much, lentivirus works really good. But last time I
was doing A549 and I need the expression level to be really high to secrete
a lot of soluble proteins for ELISA detection, none of methods (
electroporation, nucleous transfection, lentivirus) or selection markers (I
tried multiple ones) worked. |
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o**4
发帖数: 35028 | 41 siRNA是瞬时转染，只能维持几天，对于一般细胞来说，比shRNA lentivirus简单好用。
shRNA lentivirus主要是为了稳定转染，建立knockdown的细胞系，需要构建质粒、做
病毒，然后infection，麻烦些。 |
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B****n
发帖数: 22 | 42 我也找一个能替代293的，容易转染又贴壁比较结实的。做lentivirus的时候每次都要
小心翼翼的加培养基，很不爽。
能用cos7直接替换293T么做lentivirus么？ |
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h******t
发帖数: 56 | 43 这个问题我也正在纠结中，我老板倒是在她postdoc期间怀孕声孩子的，她怀孕前和期
间也一直在做lentivirus,她实验室内同时有人在做HIV。不知道还有没有别人现身说法。
我个人感觉，如果不被virus感染，那是肯定没有问题的，如果只是被没有复制能力的
lentivirus 感染，应该也没有什么问题，但是如果是自己亲身在做活病毒，就得非常
小心了。不知道这个想法是不是对的，希望有牛人们来纠正。 |
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t**********a
发帖数: 14 | 44 我用的lentivirus 感染而不是siRNA。
lentivirus感染后第二天换液，不加puromycin筛选，前2天细胞长得好好的，3天后细
胞开始减少，而对照一直长得好。
如果加pyromycin筛选的话3-5天后细胞开始减少（未感染的blank细胞在加puromycin后
第二天几乎全死光），直到剩下寥寥无几（估计是感染效率不高的细胞），得1-2周后
才慢慢长满，此时细胞生长仍然慢于对照细胞。 |
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d*******3
发帖数: 8598 | 45 J Gene Med. 2007 Jul;9(7):579-84.
Optimized production and concentration of lentiviral vectors containing
large inserts.
al Yacoub N, Romanowska M, Haritonova N, Foerster J.
Author information
Abstract
Generation of high titer lentiviral stocks and efficient virus concentration
are central to maximize the utility of lentiviral technology. Here we
evaluate published protocols for lentivirus production on a range of
transfer vectors differing in size (7.5-13.2 kb). We present a modified
virus prod... 阅读全帖 |
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w********y
发帖数: 288 | 46 谢谢，你是说用正常情况lentivirus都装不进去？另外我听说lentivirus效率就不高，
用来做behavior rescure实验，即便能做出来，好多人也不认可，你觉这种说法对吗？
谢谢！ |
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p*******r
发帖数: 59 | 47 想用 CRISPR knockout human cell line的基因, 有必要用 knicking cas9吗?
Cutting cas9 的off-target 可能性大吗？
293T细胞如果有９０％的transfection efficiency for plasmids, 如果不筛选的话有
多少细胞的基因最后会被knockout呢? 能不能不做drug selection or GFP FACS, 就做
一下预实验看看基因作用？像siRNA一样用?
有必要用Lentivirus吗? Lentivirus是不是主要在做难转化的细胞的时候用的？
Thanks! |
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m*********D
发帖数: 1727 | 48 先谢谢！再问问题：
lentivirus和普通的lipofectamine transfection比较，除了transfected 的效率高外
，带进去的基因的表达时间会更长久一些吗？在单个细胞里的表达量会高一些吗？lipo
-based的transfection一般是两天后到顶峰，三天后下降。要是virus-based的方法在
单个细胞里的表达量大，表达时间也长一些的话，也许edit两个拷贝的机会就大了。以
前作过lentivirus的shRNA,操作上应该不难。 |
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i**b
发帖数: 918 | 49 这不是纯粹进行可行性探讨么……
再说了aav做基因治疗的不是很常见么……
再不行搞lentivirus/retrovirus过量表达，丢进去可以表达一辈子了……
一次注射，终生受益哈哈。 |
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i**b
发帖数: 918 | 50 我们做病毒学实验还不带套套呢。
用的还是LENTIVIRUS哦（其实就是HIV啦）。 |
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