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j****x
发帖数: 1704 | 3 不管是什么病毒，作为载体，都是用来介导gene delivery，把目标gene靶向靶细胞，
包装的显然是核酸不是蛋白。
慢病毒作为载体，你的目的基因整合到靶细胞的基因组然后再表达，stable
expression.
病毒不是无限大，自然也不可能无限大，就有一个包装能力的问题，天然HIV 9kb多吧
，作为载体包装极限也就是10kb的样子，再大病毒capsid里就放不下了，前面那个哥们
已经说的很清楚了，序列越长，包装效率越差，病毒产量越低。
你这里的基本概念，很混乱啊 |
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o**4
发帖数: 35028 | 4 不好意思对病毒确实不太了解，
10kb是我的整个质粒大小，RNA应该比10kb小，包装应该没问题么？ |
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i*****i
发帖数: 154 | 5 包装入病毒的是3LTR和5LTR之间，含有packaging sequence的那一段，除此之外的序列
是不会包进病毒的，例如神马氨苄抗性基因，puc ori等东西。所以计算的时候要扣除
这些东西。整个质粒10kb，包装的RNA估计8K左右（去掉2k的零碎）。所以应该没有什
么问题。Open biosystem的pTripz shRNA的质粒有13K，照样包装。 |
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B******o
发帖数: 496 | 6 你这个vector基本已经到lenvirus packaging的极限了。效率那是相当相当相当的低，
呵呵 |
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j*****q
发帖数: 82 | 7 问题有点狗血啊，但是还真存在。
现在的实验条件没有s2 level的，但是这个事情不得不做。
哪位大大有这样的信息啊。听说有个公司可以做的，但是一直没找到。
跪求信息。
或者在target细胞里同时表达receptor,有这样的做法吗？ |
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z*******6
发帖数: 679 | 8 lenti一定要在p2里面包吗？这些都是假病毒，根本没必要在p2里做啊。。。 |
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z*******6
发帖数: 679 | 9 I'm sorry if I didn't get your question... |
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j****x
发帖数: 1704 | 10 是你自己要做还是老板提议的？
有必要提醒你，德国对实验室生物安全的管理严格到变态的地步，违规操作会给你个人
和实验室带来极为严重的后果
操作慢病毒载体（活病毒，无论是否三代四代安全性载体），必须在生物安全2级（
BSL2）以上实验室及相关配套设施条件下进行，没有任何余地compromise。
s2 |
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j****x
发帖数: 1704 | 11 你在搞笑。。。
好吧，如果你（或者你公司）不得不用，那就好自为之吧。身为外国人，建议你注意保
护自己的权益，别一旦出了事被牺牲掉了，这是有先例的。 |
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h********n
发帖数: 4079 | 12 美国用的是 BSL 1-4的标准.
你找同一个学校的实验室合作就行了.
s2 |
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r***e
发帖数: 2539 | 13 普通的cell culture就是BSL2，他们说的s2不知道是不是一样。
我们是lenti lab，就是普通cell culture的hood。 |
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j*****q
发帖数: 82 | 14 搞笑不搞笑就不劳操心了。哪都有black box的。
能在S2下做偶就不来同了。偶们最后要用robot，还是进production的。只能S1，不然
fda也过不了。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 15 FDA过不了？看来你是真的不懂。。。机器人也好，中试话制备也罢，该什么要求就什
么要求。否则你产出的东西有谁敢用，你又怎么敢往外摆？ 相关材料一公布，这就是
找死的行为。实在对你们公司的专业性不乐观，当然，如果是你自己的个人行我就不说
啥了。
如果你对生物制剂有一定的了解的话，你就应该清楚，相应的GMP厂房对生物安全相关
操作的限制。
anyway，忠言逆耳，你到了一个新地方新公司想积极表现一下的心理可以理解。但是，
请不要拿自己的专业性来开玩笑 |
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j*****q
发帖数: 82 | 16 原来ls的已经权威的表达过了还是从实验室安全手册里采来的信息，受教了。
说black box是让LS的不要太愚腐。偶在德国快10年了德国人到底怎么样还算知道一二
。就这种技术问题拿实验室安全手册来做判段，可见ls的已经学到德国人的精髓了。 |
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d********n
发帖数: 1013 | 17 理论上所有枪头培养皿都要bleach消毒，我们实验室现在都直接扔身边垃圾袋了。 |
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r****2
发帖数: 238 | 18 谢谢。
您的意思是说毒性不大吗？不会是因为做的多或者不小心然后会导致人感染吗？ |
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A****9
发帖数: 262 | 19 濠城不吃进去就没事。不过还是要注意不要用破损皮肤直接接触。这东西不会吸入传播
的 |
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r***e
发帖数: 2539 | 20 lenti最擅长infect human cells，much higher efficiency than infecting mouse c
ells。 |
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f***k
发帖数: 143 | 21 它会感染人的细胞,但是它没有复制的能力,所以也就是个transfection而已~~不用太擔心 |
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h********n
发帖数: 4079 | 22 如果表达的是一个很强的oncogene, 感染的细胞有可能癌变.
擔心 |
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f***k
发帖数: 143 | 23 那到是!! 那还真要看原作都做些什么基因了, 如果只是GFP就好了, 亮一亮就是了~~~~
~~ |
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B******o
发帖数: 496 | 24 KRas自己能干这个活么？好像需要同时把p53搞掉吧？ |
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B****a
发帖数: 1526 | 25 只要不会aerosolized, biosafety level 2的hood就完全没事。当然bleach消毒用过的
器皿还是必须的。 |
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a*********n
发帖数: 2526 | 26 如果是强promotor， 表达oncogen， 打死我也不做 |
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z*****g
发帖数: 306 | 27 NO oncogene into Lenti-X -- please read Clontech's mannual. Never oncogene.
BioSafety Level II is for Lenti-X and cell culture. After packaging, the
virions are in the dish or freezer. It should be safe.... I made 3 Lenti |
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c**********5
发帖数: 653 | 28 How about expression SV40 Large T-antigen (proto-oncogene) after Pcmv |
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d**********2
发帖数: 103 | 30 小弟有点问题想向各位大牛请教：
小弟在用利用LENTIVIRUS在细胞里面过表达一个蛋白。
用得载体是LV-CMV-GFP, 包装载体是CMV-VSVG 和pHR`-CMV-R8.20-Vpr.
现在的问题在于，可以成功拿到表达GFP的病毒，但是拿不到能表达我的蛋白（GFP
fusion）的病毒（被感染的细胞没有GFP荧光信号）。
我在制造病毒的时候，我知道我的蛋白表达得很好（有特定得PATTERN， 荧光信号也很
强），所以应该是CONSTRUCT应该没有问题。问题可能在于我得蛋白会引起细胞凋亡而
影响病毒得产生和包装，但是我有相应的 non-toxic 的点突变，但是我也无法拿到表
达这个点突变基因的病毒。。。所以比较迷茫，想问问大牛们有啥好的解决方法。。。
。（基因不大，才700多BP。。。）
谢谢！！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 31 晚期chronic lymphocytic leukemia直到目前为止除了骨髓移植没有有效疗法。
University of Pennsylvania 的Dr Carl June和Dr David Porter研究组，
使用lentivirus 来改造病人的白细胞，使之获得能够在体内复制几代的能力
并能特异识别和杀灭chronic lymphocytic leukemia 细胞。
三个晚期病人自愿采取了这个疗法。
经过改造后的白细胞重新注入晚期chronic lymphocytic leukemia病人后取得
非常显著的效果。目前三个测试病人中有两个的chronic lymphocytic leukemia
细胞完全消失，已经达一年未复发，另外一个也有明显改善。超过任何以前对
晚期chronic lymphocytic leukemia （非骨髓移植疗法）的治疗记录。
相关文章发表在：
11 August, in two journals: the New England Journal of Medicine and Science
Translational Medicine.
... 阅读全帖 |
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S******9
发帖数: 2837 | 32 我请教楼上2位一个问题：
lentivirus导入以后会不会导致淋巴瘤的发生增加？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 33 Lentivirus 是在体外导入的。
是把病人的正常白细胞提取出来后在体外处理，然后诱导成功的细胞经过筛选后
才重新注射回病人体内。
在理论上，当然是有一定风险会导致被处理后的白细胞成为癌细胞，但是只要
处理得当和筛选得当，其风险应该不高,相对于晚期白血病的死亡率的风险
那就是小菜一碟。
而且，病人本来就有白血病了，大不了就是又注射进另外一株白血病细胞。。。
所谓的死猪不怕开水烫？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 34 呵呵，那是。其实很多用lentivirus 的人都是在实验初始阶段用这个
（因为好使），一拿到了初步结果立刻就去用RNA,甚至protein 去做，
就是想撇清这个关系。 |
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C*****h
发帖数: 926 | 36 titer会低一两个数量级，但是不会是零。
你的问题是，根本没有virus，所以，应该是别的原因。 |
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W**S
发帖数: 275 | 37 多谢！看来要做个MIDIPREP，这次MINIPREP的完全不WORK,CELL死光光了。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 38 质粒浓度很低，纯度很差的话，差出N个数量级一点不奇怪，如果内毒素再高一点，不
出毒也很正常 |
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C*****h
发帖数: 926 | 39 miniprep的DNA质量，再怎么也不会太差。
我的经验是，我用miniprep做的virus，比midiprep的要高。
我现在一直就是用miniprep的DNA，做virus，没有出现过问题。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 40 这个难说，mini的KIT质量是良莠不齐，我曾经用过一个之后连GFP转染都有问题的。
按LZ的说法，抽提的质粒浓度低质量差的话，本身就说明不正常。 |
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C*****h
发帖数: 926 | 41 把elute下来的DNA，用酒精沉淀一下就行了。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 42 我们实验室的标准是,midi或者maxi，如果用mini, 必须是qiacube做出来的 |
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w***x
发帖数: 265 | 43 我有个同学本科后的gap year在uva某实验室做实验，从来没有任何双休日和假期，每
天工作差不多12个小时。。。
最发指的是伊老板只给伊400美元/月的工资。伊干的是postdoc的活（解剖、
lentivirus转染、生化分析、电生理全套），就拿这么点工资，还没假期真是太灭绝人
性了。 |
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g****y
发帖数: 101 | 44 大家好,
我有一个课题是通过抑制一个oncogene的功能来治疗这个基因突变（Gain of function
）引起的癌症（T cell leukemia），之前通过molecular docking从NCI 筛选小分子化
合物来抑制蛋白与蛋白的相互作用，做的不是很理想。
最近想通过SiRNA或者ShRNA抑制这个基因的表达，最终目的是为了能在体内有效的特异
地抑制肿瘤细胞里这个oncogene的表达，从而可以选择性的杀死肿瘤细胞。对这个领域
不是很熟悉，读了一些文献之后上来寻求大家的帮助，
预见的可能问题及解决方法：
1：SiRNA 或者ShRNA的特异性：
SiRNA 或者ShRNA可能会非特异的抑制其它基因的表达，可以通过仔细选择SiRNA 或者
ShRNA的序列(避免同源序列)来降低非特异抑制，请问大家还有什么办法来提高特异性
吗？
2：体外合成的SiRNA在体内容易被降解：
通过对SiRNA进行一定的修饰可以提高稳定性，但是我觉得通过病毒介导表达ShRNA 可
能是一个更好的办法，因为这个是由基因突变（Gain of function）产生的疾病，体外
合成的SiRNA不能... 阅读全帖 |
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f*******a
发帖数: 671 | 45 哈哈,我也正打算做相似的试验,培养loxp元代细胞再转表达cre的lentivirus |
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m****M
发帖数: 360 | 46 谁有shRNA Screening的经验，给参谋一下。
涉及到的问题
１。同一个老鼠基因的SHRNA是否在所有组织的细胞中KNOCKDOWN效率都是一样的？
２。什么病毒的侵染效率最高？Lentivirus还是Adenovirus?
本人想screen一个老鼠基因的shRNA，从５个shRNA中找到knockdown效率最高的一个shRNA （针对同一个基因）。由于要转化的细胞系比较难转化，准备在一个比较容易转化的细胞系里screen，比如3T3L1等。等筛选到knockdown效率最高的shRNA后，做成病毒去侵染我最后的细胞系。为了偷懒，不想把５个shRNA都做成病毒，请问此方法是否可行？有没有这样做的大狭？
谢谢。 |
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m****M
发帖数: 360 | 47 谁有shRNA Screening的经验，给参谋一下。
涉及到的问题
１。同一个老鼠基因的SHRNA是否在所有组织的细胞中KNOCKDOWN效率都是一样的？
２。什么病毒的侵染效率最高？Lentivirus还是Adenovirus?
本人想screen一个老鼠基因的shRNA，从５个shRNA中找到knockdown效率最高的一个shRNA （针对同一个基因）。由于要转化的细胞系比较难转化，准备在一个比较容易转化的细胞系里screen，比如3T3L1等。等筛选到knockdown效率最高的shRNA后，做成病毒去侵染我最后的细胞系。为了偷懒，不想把５个shRNA都做成病毒，请问此方法是否可行？有没有这样做的大狭？
谢谢。 |
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l********s
发帖数: 70 | 48 我需要说一下， 当然是adenovrius 高啊， 但是 adenovrius 不是稳定表达的，是瞬
时表达的。 lentivirus 是稳定表达的插入染色体 |
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j****x
发帖数: 1704 | 49 有对照吗？
尝试降低vsvg包膜蛋白质粒在转染时的配比，vsvg的毒性对很多细胞比较强。另外就是
尽量提高包装效率，用尽量少的病毒上清感染
primary |
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L*******e
发帖数: 2153 | 50 The virus I used is high efficient, it has been tested previously by other
labs on multiple cell lines and stem cells, but not primary rat neuronal
culture. I had a control with polybrene alone, it was toxic. I also
increased the quantity of virus I used, which helped a little bit. The only
thing I haven't tried is to adjust the ratio between virus and polybrene. So
frustrated.....
PS: love your profile photo : ) |
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