o******g
发帖数: 10263 | 1 i don't know. it's probably the curry lenti that i had for lunch Tuesday,
nnd |
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r***e
发帖数: 2539 | 2 有可能。
另外看一下你的载体有没有重组，掉了一段，影响包装。
但是单独转染看不出问题。lenti很容易重组的。 |
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h******y
发帖数: 1374 | 3 为什么不自己去提质粒，做病毒呢
Open现在还有lenti的inducible shRNA vector,只需要一次infection
down |
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m*****u
发帖数: 15526 | 4 你等了多长时间看没有？lenti感染表达起来很慢的，4,5天之后才慢慢出来很正常。 |
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v*******a
发帖数: 759 | 5 how about lenti viral shRNA vector? |
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a****d
发帖数: 1919 | 6 从起始密码子开始，序列是这样的：
ATGCCGGCCGGCCGCGCCGCGCGC
gene本身65％GC含量,1.3Kb
打算从ES cell的cDNA pool中clone到lenti over expression vector，ES cell的cDNA
pool是从mRNA反转录得到的。目前试过TAKARA的LA taq，GC buffer，with or
without DMSO(5%),做了gradient Tm， 从53－58度，结果任何一个条件都不能PCR出片
断。现在想是不是因为起始序列太特别了，有没有特别的办法把这个ORF扩增出来？ |
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s******r
发帖数: 2876 | 7 你先看看这个基因有没有的卖，用纯的plasmid作template容易一点。
在你可以考虑在atg之前寻找合适的primer，先得到PCR product
然后再PCR ORF。
roche有一个high gc的PCR kit，用过还行。
从起始密码子开始，序列是这样的：
ATGCCGGCCGGCCGCGCCGCGCGC
gene本身65％GC含量,1.3Kb
打算从ES cell的cDNA pool中clone到lenti over expression vector，ES cell的cDNA
pool是从mRNA反转录得到的。目前试过TAKARA的LA taq，GC buffer，with or
without DMSO(5%),做了gradient Tm， 从53－58度，结果任何一个条件都不能PCR出片
断。现在想是不是因为起始序列太特别了，有没有特别的办法把这个ORF扩增出来？ |
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r*****m
发帖数: 231 | 8 把需要的位点设计在PCR引物的两端，PCR后用酶切然后连上vector。你的Lenti vector
应该至少有7，8kb吧，连个4kb的一般不会出问题。一般人做PCR cloning都是这么做的
，做不出来的才用TOPO。但你是TOPO都做不出来，就不知道为什么了。。。检查下你的
Taq是不是有问题吧。。。 |
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t******8
发帖数: 478 | 10 我用过lenti和AAV，在neuron里面可以阿。 |
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e***o
发帖数: 344 | 11 版上各个领域的牛人不少，集思广益，大家来说说自己的一手心得体会吧，说不定这个
帖子就变成一个chapter了呢
各种病毒载体如 AAV,HSV,AV,VSV， Lenti,PRV,Rabies，还有 amplicon。。。。。都来说说
什么安全性，宿主细胞，表达效率，免疫原性，毒性，一起“研究研究” |
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H*****e
发帖数: 120 | 12 Also asking:
Can 293T cells stably infected by one retro- or lenti-virus produce virus if
transfected with the packing system again? |
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l*****m
发帖数: 122 | 13 You're absolutely right...I've seen tons of papers using either lenti- or
retro-virus to transduce BMDCs. Although the protocols vary a little bit
from one to another, none of them worked for me so far :(
I don't see much cell death by PI staining, but the pattern of the side/
forward scatter of the transduced cells does look a little different from
that of the untransduced cells (gated on live cells only). And more
importantly, CD11c expression is highly inhibited in transduced cells.
One exper... 阅读全帖 |
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j******i
发帖数: 939 | 14 I mean insert 6kb into lenti backbone. |
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K**********e
发帖数: 188 | 15 我的基因6K 能包装出来病毒咩？
lenti最大能包装出多大的？ |
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n********k
发帖数: 2818 | 16 Spin is enough...although I never heard the 0.45 um would hurt the titer...0
.22 might...as the particle size of lenti is pretty close to that I believe.
..0.22 might be ok with retro if my memory is not wrong... |
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a********k
发帖数: 2273 | 17 sorry,没有做过lenti， 不熟悉有哪些vector可以用。有没有哪个lentiviral vector
可以同时表达两个不同的shRNA，并且有荧光marker做FACS啊？ |
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s******r
发帖数: 2876 | 19 天然的miRNA也有很多同时表达的吧，
你可以模拟他那个结构，用pTRIPZ来表达。
sorry,没有做过lenti， 不熟悉有哪些vector可以用。有没有哪个lentiviral vector
可以同时表达两个不同的shRNA，并且有荧光marker做FACS啊？ |
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P******r
发帖数: 11 | 20 我的理解Lentivirus 是慢的，不会很快见到GFP。摘自维基百科：
Lentivirus (lenti-, Latin for "slow") is a genus of slow viruses of the
Retroviridae family, characterized by a long incubation period. Lentiviruses
can deliver a significant amount of genetic information into the DNA of the
host cell and have the unique ability among retroviruses of being able to
replicate in non-dividing cells。 |
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j*******n
发帖数: 62 | 21 virus有好多种，看现在多用lenti和adeno，为啥没有其它的呢？另外使用重组表达单
抗的病毒作为药物载体的概念很早就有了，怎么现在看不到什么进展了？遇到什么问题
了吗？对这个东西很好奇，哪位业内的大牛能给答疑解惑下？ |
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e***o
发帖数: 344 | 22 再次感谢各位的回复与建议。
受益匪浅！我手里的是AAV，不知道AAV降到一定的MOI后是否和lenti一样。 |
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y**u
发帖数: 7459 | 25 那adnorvirus呢，和lenti比
危险主要指哪个方面？infect human? through what? |
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y**u
发帖数: 7459 | 26 Thanks a lot! I was hesitating between adeno and lenti.
BTW do you know about semi-forest virus? in terms of efficiency and safety
issues? Thanks!
means |
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j******i
发帖数: 939 | 27 You got me! Adv can transduce nondividing cells for sure! A PI who I
respected most told me that Adv can not
infect non-dividing cells, so I never doubt about it!
Yes, uncertain insertional property with preference to genes is a major
limitation of using lentivirus. Although
its insertion characteristic is modified by combining with transposon and ZF
, these chimeras are less efficient
in titer and transduction compared to wide type.
Totally agree that site-directed lenti will be a great achieve... 阅读全帖 |
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j******i
发帖数: 939 | 28 Virus working should be done in class II lab. But no need to wear face mask
and actually it's quite safe if you
obey the virus working rule. Just need sometime to get used to it.
I have no experience with semi-forest virus. In most cases, if you want
your gene transiently expressed you
can choose episomal virus like Adv, in you want gene consistently expressed
you can turn to insertional virus.
Adv and lenti are well defined and commercial. |
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D******y
发帖数: 723 | 29 we use lenti-virus carrying shRNA
down |
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s*********t
发帖数: 600 | 33 可不可以打病毒进去啊？
lenti－包装你的需要过表达的基因，打进老鼠的肝脏部位。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 34 Hydrodynamic Tail Vein的效率应该是非常好的，如果在你这里效率很低，那么很可能
要么是手法问题，要么是构建问题，可以先用luciferase reporter construct做对照
检查一下手法。
一过性表达HTV足够了，想持久表达那就得上病毒载体了，lenti或者AAV都是非常好的
选择 |
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r***e
发帖数: 2539 | 35 lenti也不好感染，常见10-20%。
retro可能比较好些。
容易 |
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z*******6
发帖数: 679 | 36 lenti一定要在p2里面包吗？这些都是假病毒，根本没必要在p2里做啊。。。 |
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r***e
发帖数: 2539 | 37 普通的cell culture就是BSL2，他们说的s2不知道是不是一样。
我们是lenti lab，就是普通cell culture的hood。 |
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r***e
发帖数: 2539 | 38 lenti最擅长infect human cells，much higher efficiency than infecting mouse c
ells。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 39 10%足够了，我认识有几个组用这个系统做entry inhibitor的筛选，效果还不错，有几
个candidates已经开始准备Phase I trial了。10%和15%的差异主要看批次和人手，同
批细胞之间的差异很小（所以实际上Variation没有想象的大），但不同人工之间的差
异不小，属于技术活。主要的问题在，1.这细胞得持续分化1个月以上才能正常感染，
其间不能出任何岔子，否则前功尽弃。一个月后究竟能不能用，谁也不知道，用了才知
道。2. 细胞极其敏感，转染效率低是一定的，siRNA基本没法用。用Lenti转导shRNA吧
，转导完了细胞分化又出问题，更不能用。最主要的是，欧美对HBV这玩艺儿的重视程
度远低于HCV，做的人少自然没结果。要是像HIV那么投入，问题估计已经解决了。
PreS的问题我觉得没有什么争议，Anti-preS Ab有中和抗体活性，结构分析等等证据也
表明了，PreS就是结合受体的（至少是受体之一）。至于能不能一下子找全，谁也没把
握。一个一个来呗。HCV找到现在还不是一样没结论，虽然CD81, SR-BI, DC-SIGN,
Claudin-1,Oc... 阅读全帖 |
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j****x
发帖数: 1704 | 40 10%足够了，我认识有几个组用这个系统做entry inhibitor的筛选，效果还不错，有几
个candidates已经开始准备Phase I trial了。10%和15%的差异主要看批次和人手，同
批细胞之间的差异很小（所以实际上Variation没有想象的大），但不同人工之间的差
异不小，属于技术活。主要的问题在，1.这细胞得持续分化1个月以上才能正常感染，
其间不能出任何岔子，否则前功尽弃。一个月后究竟能不能用，谁也不知道，用了才知
道。2. 细胞极其敏感，转染效率低是一定的，siRNA基本没法用。用Lenti转导shRNA吧
，转导完了细胞分化又出问题，更不能用。最主要的是，欧美对HBV这玩艺儿的重视程
度远低于HCV，做的人少自然没结果。要是像HIV那么投入，问题估计已经解决了。
PreS的问题我觉得没有什么争议，Anti-preS Ab有中和抗体活性，结构分析等等证据也
表明了，PreS就是结合受体的（至少是受体之一）。至于能不能一下子找全，谁也没把
握。一个一个来呗。HCV找到现在还不是一样没结论，虽然CD81, SR-BI, DC-SIGN,
Claudin-1,Oc... 阅读全帖 |
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h***a
发帖数: 145 | 42 从来没做过，想要over express IFNa，看看能不能直接从公司买。。
多谢拉！ |
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A******y
发帖数: 2041 | 43 I was recommended using genecopoeia. However, just ordered one 1mL virus
and the plasmid construct, but haven't test it. Their shRNA plasmids are
working though. |
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h***a
发帖数: 145 | 44 thanks a lot.. Will take a look. |
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r***e
发帖数: 2539 | 45 刚看懂你的问题。
packing signal alone is not enough.
直接找lenti-transfer vector，加进你的promoter+gene。 |
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e**o
发帖数: 345 | 46 做个表达lenti V， 用hela做softagar，看看有没有变化。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 48 我也正觉得奇怪呢。
Lenti 和retro是不一样的，lentivirus 即使在细胞不分裂的时候也能感染细胞，
retrovirus 就必须细胞分裂的时候才能成功感染，所以假如target cell 进入
confluent status 发生contact inhibition 之后就会导致效率大大下降
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d*p
发帖数: 534 | 49 这几年一直在做高通量的shRNA筛选，感觉现有的产品有很大缺陷，想开发以下产品：
现在做功能研究比较快,能够进行高通量的就是knockdown and over-expression 这两
种方法。因此想做下面两类产品：
1， 覆盖全基因组的shRNA和siRNA， 每个基因两条， 每条的knockdown效率经过验证
，保证大于80%，提供蛋白水平的knockdown结果。
2， 覆盖全基因组的cDNA表达库，克隆每个基因的cDNA到Lenti-vector, 带上Barcode。
算了一下成本，用我的方法，大概5m 美元能够做完人和小鼠的这两个库，Broad现在也
在做，但是他们的方法效率太低，结果还非常不可靠，按他们的方法，50m都不够。
完成以后,
1. 可卖单个基因的产品，和市场上的公司竞争，全球市场大概有5亿美元左右的市场。
目前市场上的shRNA基本都是卖几个给你，不知道那个有用，有时候一个有用的都没有
，或者knockdown太低，看不到表型，需要自己花时间去验证。
2. 全基因组的knockdown 和over-expression library完成后，每个基因有两... 阅读全帖 |
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