j*p
发帖数: 411 | 1 1. 理论上说,只要所研究的基因有足够的reads(最好是pair-end),那么,要确定
splicing isoforms应该不是很难的事情, 可以查询一下两个方法(我虽知道有,但都没
试过): "NSMAP: a method for spliced isoforms identification and
quantification from RNA-Seq", "SpliceTrap: a method to quantify alternative
splicing under single cellular conditions"
2. 假设,比较病人和他父母RNA splicing之后,发现有很多基因存在不同的splicing,这
并不能代表你所说的"和RNA splicing 有关的gene"上面的突变是引起这种疾病的原因,
甚至不能代表这个突变能够用来做为检测这种疾病的marker,因为sample不够.如果你说
的是这种"sample不够,没法做statistics", 那么我以为它不能通过RNA-seq来回避.
sample |
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b**********8
发帖数: 349 | 2 的确，靶基因有两个isoforms，不过我们设计的shRNA 对两个isoforms都能target。 |
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n******7
发帖数: 12463 | 3 情况大概是这样：我们做了很多cDNA clone，测序之后选取了一些进行了下游的实验，
主要是in vitro 的protein实验。我们鉴定了很多新的splicing isoform，其中有不少
有premature stop codon(可以是splicing 造成的，也可以使indel造成的）
现在我们想做一些quality control，去掉一些不靠谱的transcripts，于是出现了分歧
组里的大姐想法是要尽量跟已知的protein一致。把每条isoform对应的protein align
到已有的protein sequence上。如果整条protein基本align上去，即便使truncated
protein, 不管什么原因，都可以作为partial protein 保留。但是如果shifted frame
的amino acid sequence长到一定程度，那就认为这些protein sequence跟已有的
sequence太不一样，要除去
我完全明白大姐为什么那么想，因为我们实际test的是一些protein sequences
但是就我这部分工作，我需要关... 阅读全帖 |
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n******7
发帖数: 12463 | 4
我的一些不太成熟的看法，要是不对请见谅。
1）如果你们的下游工作是validation，当然是越stringent越有可能被你validate到，
你可以把你的filter和你大姐的combine了。实际上你已经有下游的validation了，你
是不是有可能知道错误都发生在哪一步？根据你的validation的结果来inform你应该进
行什么样的filter。
下游的工作不是validation，是一些in vitro的性质实验，所以不太清楚到底跟生物体
差别多大
2）如果你们做的是human或者model organism的数据，而你们想要看看你们的序列是不
是真实正确，可以和现有的cDNA数据库，甚至是最近的rna-seq的数据比较，如果在别
的数据里也出现过，应该可以认为是真实的序列。
有不少是跟已知的overlap的，但是我们更关注新发现的isoform是不是可靠
3）大部分的人的和模式生物的alternative splicing应该都已经被annotate到了，并
且你们研究的对象是wild type的，那么和已有的annotation比较应该是一个很好"
cross... 阅读全帖 |
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n******7
发帖数: 12463 | 5
PCR的error有一些，有些clone很奇怪，做了SANGER出来一些不知道哪里的序列。还有
rRNA的序列都弄出来了
我做的assembly，为了保证data size，有些cutoff设定的不是很严格，所以有些区域
的分值不高。还有一些alignment的问题，我发现过几个错误。 我们的目的是发现一些
新的iso，所以ref sequence并不是总有用。
保守没办法，我们的实验pipeline有些assumption，其实是不完全对的。加上我们最后
研究的使protein，这个对mrna序列太敏感了，只好保守一点。除非老板或者合作者愿
意做一些protein level的高通量严重，比如MS之类。。。
我们想发现全长isoform
RNA-seq目前只能研究splicing sites吧？ Cufflinks，scripture什么的出来的
isoform还是根据splicing site预测的，不一定真实存在。 做clone的目的也是为了
克服RNA-seq的这个缺点。我们选了一组gene set做的clone，手上几组数据大概一共测
序了36K的clone |
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x*******t
发帖数: 3764 | 6 很多大牛觉得虫子很好，而且很多有争议的结论大牛们也都在等着虫子或者fly里面的
结果，绝大部分重要基因的功能都是很保守的。而且虫子独特的优势使得实验设计思路
快捷明朗，最简单的，有些基因在老鼠里面会有很多isoform，相互有代偿，你可去使
劲儿KO吧，虫子反倒好很多，简单，说不定对应的就一个isoform。
另外在虫子里面套mamal的pathway，其实也有意义，不光是简单的说“你看，虫子里面
也有”，其实可以做的更深入，
circuit很好啊，比如从sensory neuron,inter neuron, motor nueron这样的circuit
如何传递信息导致行为改变，或者学习记忆，这在老鼠里面可能很难实现 |
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D******9
发帖数: 2665 | 7 could be a small isoform. there are many reports about small isoforms of
Stat family. however, some researchers think they are caused by protein
degradation during cell lysate preparation. |
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i*********0
发帖数: 915 | 8 Just got the reply from the CST. It seems the lower band is isoform beta.
Dear @@@@,
Thank you for your inquiry regarding our Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP&#
174; Rabbit mAb #9145. The top band, at 86kDa, represents Phospho-
Stat3alpha. The bottom band, at 79kDa, represents Phospho-Stat3beta isoform
. |
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n********k
发帖数: 2818 | 9 a couple of questions:
1. Are you very experienced with molecular biology? no offense, u sounds a newbie to me...So a control question here: can you successful do other
short-ones say1-2kb or even less easily with the protocol...
2. do you know the exact sequence of the isoform(s), or you are trying to
use primers on the two extremes to fish out any possible isoforms(known or
unknow)?
3. With that, check your sequence complexity bioinformatic...anything
peculiar with your sequence?
4. if 1 and... 阅读全帖 |
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l***y
发帖数: 4671 | 10 这俩各有侧重，很难互相取代吧。尤其是 NGS 的数据在 accuracy 上还远不能和
microarray 竞争。不说别的，shotgun of RNA 从原理上就使得其测试结果有很大的
bias，使得测 isoform 时不如 isoform array 精确。而 sequencing depth 又直接决
定了 alignment 的可靠性。对于低表达的 RNA，远不如 microarray 更靠谱。
NGS 的作用是 explore for novel transcripts。定量还得 microarray，又便宜又准
。所以我觉得 NGS 的大量使用反而会进一步促进 microassay 的 probe design。
学术界喜新厌旧是常态。但是要想得到靠谱的结果来指导实验和 hypothesis，
microarray 还是 golden standard。
其实呢，两种数据都做过后，就知道其中的异同了。当然了，很多人不自己做 RNA-seq
和 microarray 的 raw data processing，想当然地拿别人的 pipeline 来处理一下
，或者分析结果... 阅读全帖 |
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t**********2
发帖数: 133 | 11 比如说 腺苷酸环化酶， 哺乳动物有大约10种， 生物学上称他们是 isoforms, 是不是
所有的isoforms 都是同样的功能呢？
如何寻找同样功能的酶呢？ 同工酶吗？ 如果不是酶呢，又怎么称呼？ 有这样的数据
库吗？ |
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t**********2
发帖数: 133 | 12 比如说 腺苷酸环化酶， 哺乳动物有大约10种， 生物学上称他们是 isoforms, 是不是
所有的isoforms 都是同样的功能呢？
如何寻找同样功能的酶呢？ 同工酶吗？ 如果不是酶呢，又怎么称呼？ 有这样的数据
库吗？ |
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p*****p
发帖数: 61 | 13 不是很明白你的问题：
你的差异表达分析是对什么最差异分析（差异表达的Tag）？
对于组装很完善的大鼠大基因组，要注意的是不要把那些短的CONTIG一起全部做
REFERENCE，可能会给MAPPING带来问题--比如很多CONTIG和主要染色体有序列高度相似
的地方，会导致最后这些地方没有MAPPING报告。具体没有做到过大鼠，猜测可能有这
样的问题。
至于后面的差异分析，我的理解是，如果你提供了基因的注释（ANNOTATION）要基于
MAP到一定的基因特征（EXON，ISOFORM，GENE）上的READS的分析。那么你用哪个版本
的注释比较会影响你说到的有很多对不到基因上（你用的那个注释的版本和你关注比较
的基因不完全的一样）。
要是用泪水CUFFLINKS类似的工具不提供基因组注释而组装的ISOFROM 或者GENE的分析
，如果发现差异表达的ISOFORM或者基因不在作者感兴趣的基因序列里，只能说明这些
工具从RNA-SEQ数据发现了新的基因了。
不知道是不是猜对你的问题。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 14 De rien.
plus this one:
Shioda N et al. (2012)
Expression of a Truncated Form of the Endoplasmic Reticulum Chaperone
Protein, σ1 Receptor, Promotes Mitochondrial Energy Depletion and Apoptosis
JBC 287: 23318-31.
Abstract
The σ1 receptor (σ(1)R) regulates endoplasmic reticulum (ER)/mitochondrial
interorganellar Ca(2+) mobilization through the inositol 1,4,5-
trisphosphate receptor (IP(3)R). Here, we observed that expression of a
novel splice variant of σ(1)R, termed short form σ(1)R (σ(1)SR), has... 阅读全帖 |
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S******e
发帖数: 393 | 15 有一个目的我知道就是产生不同size的isoform，这个好理解。
但我在NCBI里查一个gene, 它有几个不同的transcript variant,但貌似只是
UTR长短不同，产生的蛋白是一样的(即同一个isoform)，那要这种不同的transcript
variant什么用， 控制translation level，调节表达量？ 还有其他作用吗？ |
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s******9
发帖数: 283 | 16 NCBI protein database一般都有标注吧。
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..503
/organism="Homo sapiens"
/db_xref="taxon:9606"
gene 1..503
/gene="TGFBR1"
/gene_synonym="ALK5"
/gene_synonym="SKR4"
Protein 1..503
/gene="TGFBR1"
/gene_synonym="ALK5"
/gene_synonym="SKR4"
... 阅读全帖 |
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b*h
发帖数: 637 | 17 请问在baylor实验外显子基因报告中一下这些列是什么意思？
The 4th column: Position
The 5th column: Isoform
The6th column: Nucleotide
The 7 the column: Amino Acid
The 8th column: Zygosity
The 10th column: AA/EA
以下是一个例子
Gene: BAG3
Position: 121429523
Isoform: NM_004281
Location: exon2
Nucleotide: C341A>G
Amino Acid pY114
Zygosity: Het
Referenc/comments: Novel variant
AA/EA: N/R N/R
PolyPhen 2: Tolerated/Benign
包子求问。多谢！ |
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发帖数: 1 | 18 ◇◇新语丝(www.xys.org)(newxys.com)(xys10.dxiong.com)◇◇
再说饶毅、管坤良实验室联合发表的论文数据造假
·方舟子·
昨天我发出《关于饶毅、管坤良实验室联合发表的论文数据造假的分析》后，
饶毅转给我他当天登在其微信公众号的文章《饶毅、管坤良就论文图片的分析》
（以下简称饶文），作为对“有人匿名散发指饶毅参与署名的9篇论文中图片有
造假问题”的回应。由于第6、7、8、9等四篇文章“不存在需要解释的地方”，
饶文称只需回应第1、2、3、4、5等五篇文章——对此我也同意，我在前文也只
分析了这五篇论文。
但是实际上饶文只回应了“饶毅需要负质量和监管责任的图片”，指的是这
两篇论文中的图片：
论文1：
J Neurosci. 2007 Jan 24; 27(4): 957–968.
p130CAS Is Required for Netrin Signaling and Commissural Axon
Guidance
Guofa Liu, Weiquan Li, Xue Gao,1,2 X... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 19
Download pdf published by SfN (Chapter from 'The History of Neuroscience in
Autobiography, Volume 8' edited by Larry R. Squire)
Yuh-Nung Jan's CV
Lily Jan's CV
Yuh-Nung Jan and Lily Jan
Birth
Family History and Growing Up
National Taiwan University
The Hiking Trip to Shitou in the Spring of 1967
Graduate School Application
Graduate Study at Caltech (1968锟974)
Seymour Benzer Lab (1974锟977)
Steve Kuffler锟絪 Lab at H... 阅读全帖 |
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N**H
发帖数: 17 | 20 站内联系。
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Desk... 阅读全帖 |
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b*****y
发帖数: 229 | 21 做hybrid的人容易发现illumina的问题而已。我说了，illumina是拿未知当已知，碰到
未知和已知明显不符的情况，问题最先暴露。hybrid只是一种情况。没有genome数据的
物种，类似hybrid的情况。
肿瘤细胞有严重的染色体异位， 缺失，短了也不行。同一个gene的不同isoform，短了
也难办。dynamic mutation造成的疾病，illumina一点都做不了。类似情况太多了，
不一一列举了。illumina的问题越来越被认识， PACB也就越被青睐。
长而准的方法一定会取代这两者是必然的。即使比illumina贵十倍。 |
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G**********n
发帖数: 754 | 22 RT.
stress induced protein identified as dermcidin isoform 2 (DCN-2) and the
systemic insulin level.
animal experiment |
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N**H
发帖数: 17 | 23 不合适的话请版主删掉
站内联系。
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m**********a
发帖数: 10817 | 24 不同的isoform 还有不同的mw?
钓鱼呢
出来 |
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s*******e
发帖数: 23 | 25 no,
to study an unknow gene, u need northern first ahead of RT-PCR.
until you have a very specific question about a gene, which
has been studied for a long time.
there are several reasons:
(1) the distribution of a gene
(2) the abundance of a gene
(3) possible isoforms of a gene
such as a simple question is here: the the gene is 3 kb or longer,
u can easily meet a lot of PCR problems to amplify it. |
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D***a
发帖数: 516 | 26 用293T细胞，转lentivirus病毒载体和gagpal+vsvg,产生的病毒是不是有一部分又感染
回到293T了？那这个会增加病毒产率（比如说感染回去，vector又可以被复制，产生新
的病毒）还是降低病毒产率（病毒被消耗掉了）？
我的一个shRNA病毒产量总是很低（一个是共转染之后293T荧光少（载体含GFP），另一
个是病毒infect target cell后筛选，得到的克隆少得多），跟control和另外一个
gene family isoform相比。我做了不加gagpal和vsvg,把载体单独转到293T里面，从
GFP荧光看plasmid质量没问题，跟control是一样的。查到有文章提到这个蛋白可以帮
助病毒entry，是不是就是病毒低的原因呢？
谢谢大家。 |
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t********9
发帖数: 536 | 27 各位大侠，我对基因方面懂得不多，现在有一个基因方面的问题向大家请教。我想找一
个基因tag-24 的promoter sequence，这个基因是c.elegans中的。下面是有关的信息
（包括了tag-24 的一个上游基因和一个下游基因）。请大侠帮忙算一下这个promoter
sequence 是多长呢？请讲讲是怎么算的。（因为tag-24 给的是complement, 我不知道
怎么办）（就按tag-24 得第一个isoform 为例吧。）多谢了！！！
gene 5604536..5609082
/locus_tag="F14D12.1"
/db_xref="GeneID:180829"
/db_xref="WormBase:WBGene00017463"
mRNA join(5604536..5604550,5604616..5604684,5604731..5604985,
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m******5
发帖数: 1383 | 28 我觉得RNA上RT也不靠谱，如果这个蛋白有多个isoform的话挺麻烦的，到时候结果不好
判断 |
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v***a
发帖数: 1242 | 29 大约于？是约大于的typo吗？
有时也可能是不同组织细胞中蛋白会有不同的modification，或者isoform，分子量就
会有上下浮动的。 |
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z**********8
发帖数: 766 | 31 感谢各位热心！
PCR片段均经过跑胶后回收。送测序的PCR均特异。不同不是指isoform，也不是SNP。
不同一般主要是几个base pair的不同，或碱基突变，或有缺失。有几个样本总是那几
个不同，有时与NCBI的database一致，有时有突变。因为有的样本重复过三次了，有的
样本可以经重复后得到相同结果，有的得到不一致的结果。我就是郁闷在这里。
我觉得clonebar (土星科学院院长)的原因3有可能解释我的问题，我猜测1）有正常细
胞混入；2）有些细胞突变了，然而同一样本内细胞突变的情况并不一致，这有可能吗？
谢谢！ |
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n******7
发帖数: 12463 | 34 谢谢！
当时头都大了，因为结果不怎么好。现在结果好多了，这个问题似乎大家都ignore了。
。。
了。 |
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b****r
发帖数: 17995 | 35 我觉得也没什么好担心的
根据我自己的实验经验，我觉得大部分剪切型可能只是很痕量的表达，只是用PCR之类
极其敏感的方法能够鉴别出来，实际上是没有什么生物学意义的。RNA转录到翻译是一
个多级调控的过程，我觉得有很多残次品很正常，实际上还是要看那些最终变成了蛋白
质才是真正有意义的 |
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n********k
发帖数: 2818 | 36 In fact, it opens up tons of questions/opportunity---in term of DNA. RNA and
Protein functions and regulation as well...so a next key question would be
whether it is just an evolution accident or it has wider implication, e.g:
it ever happens in other organism such as human, do As ever get into our DNA
/RNA/protein and play any functional/regulatory roles?
BTW, u are too greedy...if it doesn't need this DNA stuff, it would be an
instant nobel....However, I always think everything is possible, ... 阅读全帖 |
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p*****m
发帖数: 84 | 37 这个目前也是比较争论的。不过关键还是NGS的价格。
一个RNA-Seq做下来，可以分析gene expression, isoform expression, post-
transcriptional gene mutation. |
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s******s
发帖数: 13035 | 38 首先，你怎么知道你要的那个isoform是真的存在的 |
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g*********d
发帖数: 233 | 39 Here is some literature I found....
I'm interested in this gene
Thanks!
2'-5'-oligoadenylate synthetase 1 is an enzyme that in humans is encoded
by the OAS1 gene.[1][2]
This gene encodes a member of the 2-5A synthetase family, essential
proteins involved in the innate immune response to viral infection. The
encoded protein is induced by interferons and uses adenosine triphosphate
in 2'-specific nucleotidyl transfer reactions to synthesize 2',5'-
oligoadenylates (2-5As). These molecules activate ... 阅读全帖 |
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D******9
发帖数: 2665 | 40 我有个研究的基因有很多DIFFERENT ISOFORMS BECAUSE OF ALTERNATIVE SPLICING.我
想把所有的IOFORMS都CLONE了，现在NCBI数据库了不全， 除了筛选cDNAlibrary的方法
， 还有别的方法可以拿到所有的序列吗？ 我只知道基因中间的一段。谢谢 |
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l***C
发帖数: 334 | 41 很多isoform都是时间/空间特异的，你要做的样品里不一定都有表达，先弄几对引物大
概看看哪些个有表达再说吧 |
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s******s
发帖数: 13035 | 42 没做过。不过我猜用LNA，PNA这类探针，一个设计在
truncation里面，一个设计跨在两边 |
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w******e
发帖数: 1187 | 43 没理解。用A有B没有的部分做antigen不行吗？ |
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j****x
发帖数: 1704 | 45 考虑到不同的alternative isoforms，human proteome size至少应该在100K的级别，
至于确切数字，一时半会估计是搞不清的 |
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S**********l
发帖数: 3835 | 46 alternative isoform用什么工具分析？ |
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b*******l
发帖数: 217 | 47 这个酶是不是有别的isoforms? 有没有可能是compensatory response? |
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v***a
发帖数: 1242 | 48 要克隆一个gene，发现用我自己培养的细胞来PCR扩增时，大部分P不出，少数P得出。
用别人养的相同的细胞，都P不出。凡是P出来的，会有两条靠得很近很近的条带（~1.
5kb）。
然后我就挖了上面的那一条下来，做成plasmid了，测序也都完全正确。
这次要做recombinant protein，所以重新设计了primer（PCR产物很短，只有600多bp
），用上次做的现成的plasmid进行PCR，结果又P出来两条很近的条带。
有点想不通，请教一下大家这是怎么回事呢？
另，做western blot时偶尔也出现靠得很近的条带（忽而又只有一条），没有见过有相
关isoform的报导。
谢谢！ |
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D******t
发帖数: 79 | 49 That could be different isoforms. Why not clone the lower band and sequence
it? |
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v***a
发帖数: 1242 | 50 这是个好主意，下次试试。
另，isoforms到底是怎么回事呢，总是有点不甚了了，牛人能给解释一下吗？比方说我
这个例子，从plasmid是如何产生的。多谢！
sequence |
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