s******y
发帖数: 28562 | 1 因为sodium azide 会抑制 HRP 的活性。
不过现在大家都用红外荧光二抗了，反而就没有这个问题了。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 2 多谢
我可能也犯过一样的错误
我还是用HRP和AP的 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 4 你的汉字输入 就这样了 还海归同济啊
组化做信号耳机(二次) 放大是也用hrp 的? |
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b*********8
发帖数: 44 | 5 我用的FLAG 序列是：DYKDDDDK.难道 就是4个D的版本？我太惨了吧！
我也打算用M2-HRP抗体，是不是多加点抗体会好点，比如1:100稀释？再不行就要用
bead纯化了吧？ |
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b*********8
发帖数: 44 | 6 非常感谢！我再试试吧，不行就换了。我的蛋白连GFP没有功能，连HA还有功能，anti-
HA 效果怎么样？大家都用那个公司的抗体？直接买带HRP的一抗效果好那还是用一抗，
二抗？ |
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b*********8
发帖数: 44 | 7 anti-HA monoclonal antibody (12CA5; Roche)是一抗吧，二抗用什么好那？
文献中很多都用Roche的3F10,这个怎么样， Anti-HA-Peroxidase, High Affinity
from rat IgG1？ 是不是就这个一抗就有HRP了，不用二抗检测了？谢谢！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 8 不要加那个东西，
那个东西会抑制HRP
如果不小心加了，必须注意用普通的PBST or TBST 多洗几次（最少5次），
洗液里和二抗里切切不可再加sodium azide |
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b*********8
发帖数: 44 | 9 最近买了Roche的 anti-HA-peroxidase (3F10)抗体做植物中的western，结果是白板，
是怎么回事？ 大家有人用过这个抗体吗， 因为一抗本身就带了HRP，所以就不用二抗
了，不知道这种抗体是不是没有用一抗和二抗的灵敏？ |
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I***a
发帖数: 13467 | 10 今天翻出n多带标记的二抗，做western blot的，HRP标记的
还有FITC标记的，
估计10年都用不完，有些放在4度，好几年，有的在－20度，
一抗也不少
不知道还用么？
有用的话，怎么长期保存，
吐槽一下，真他妈的汗，多少年没人做western blot，试剂一大堆。 |
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s******r
发帖数: 2876 | 11 一般加成50%甘油，-20C可以放个3-5年
今天翻出n多带标记的二抗，做western blot的，HRP标记的
还有FITC标记的，
估计10年都用不完，有些放在4度，好几年，有的在－20度，
一抗也不少
不知道还用么？
有用的话，怎么长期保存，
吐槽一下，真他妈的汗，多少年没人做western blot，试剂一大堆。 |
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s*****g
发帖数: 87 | 12 最近要检测一个蛋白的表达量，但是这个蛋白在细胞内的表达量很低
请教各位达人，以下哪个方法更灵敏，或者说更有可能检测到蛋白的表达？
1. Flow cytometry after treatment of FITC-conjugated primary antibody.
2. Western blot analysis using primary antibody and HRP-conjugated secondary
antibody
谢谢！ |
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C******8
发帖数: 136 | 13 想问一下，细胞和果蝇，都能用荧光做immunostaining得到很好的结果，为什么老鼠的
文章里组织切片荧光染色这么少，基本是HRP或者x-gal的片子
还有，老鼠可以用guinea pig 或者 rat 来源的 antibody吗
因为可能会转方向，人完全傻掉了 |
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C******8
发帖数: 136 | 14
谢谢了
但为什么老鼠的文章里很少有荧光染色的？secondary antibody都是公司买的，连HRP
或者cy3没有什么区别， 而且我听不少老鼠的老板类似开玩笑的提及很羡慕果蝇文章里
一堆堆漂亮的图。
还有，老鼠的antibody是不是最喜欢用兔子的？ |
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w*****r
发帖数: 2061 | 15 老鼠脑片荧光染色难道不是到处都是，其它组织也很多
HRP |
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l********e
发帖数: 415 | 16 因为他们弱爆了 ... primary来源无所谓的 好用就行
不过我的确相信果蝇比老鼠好做 因为同源基因少
HRP |
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l******g
发帖数: 1145 | 17 最近中心新买了一台，没人用过，现在刚开始摸条件。
原来wb用hrp的二抗，通常条件是一抗4度过夜，洗30分钟，二抗1：5000或10000一小时
，洗30分钟，然后ECL显影。
现在打算摸下萤光二抗的浓度，除此之外，一抗的条件和洗膜的条件也需要调整吗？
求任何tips！ |
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D*a
发帖数: 6830 | 18 酵母有两种寿命，replicative lifespan 和 chronological lifespan，不能分裂了表
示replicative lifespan 终止，但是酵母在不能分裂了之后还能活一段时间，有点类
似人的衰老和生殖。
对单个cell来说端粒很重要，但是很多生物，老年体的细胞提取出来还能分裂十几次还
是几十次，说明细胞分裂能力并不是最终诱因，包括干细胞的保持，不光跟本身分裂能
力有关，跟其所处的niche也有很大关系。
包括c elegans里面如果过表达telomere-binding protein HRP-1可以延长端粒和寿命
，但是因为线虫体细胞不再分裂，所以端粒酶很可能确实是对衰老有影响，但是应该是
通过其他途径（比如oxidative stress神马的，paper没有细看）而不是通过维持细胞
的正常分裂能力来影响衰老。如果承认衰老是进化上普遍存在的现象，c elegans这个
例子就很有说服力。
老鼠里面有两篇关于telomerase改善老鼠衰老的症状等等的文章一篇在cancer
resistant的模型里面（否则telomerase让老鼠得各种癌症早... 阅读全帖 |
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s********n
发帖数: 248 | 19 Invitrogen V5-HRP做wb效果很好。不过听师兄说V5抗体亲和力不是非常非常好，他不推
荐做IP用 |
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b****e
发帖数: 52 | 20 谢谢大家.我现在用的是5%NGS,0.1%Tx100 blocking, 有什么区别吗? HRP coupled
anti-mouse Ab 可以用来做封蔽吗?我们lab没有uncoupled Ab. 1:5000 1hr? |
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g*****n
发帖数: 250 | 21 在5%NGS,0.1%Tx100溶液里加点抗体。NGS还得要。HRP coupled
anti-mouse Ab 可以用，只要你不用其底物来检测。1:500－1000 1hr。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 22 我们使用的是荧光二抗，就是licor的那个，不是HRP，做某蛋白的磷酸化分析，
western。
问题一，一般是先上磷酸化抗体，strip之后再上total抗体，但是这种二抗strip掉信
号很困难，大家有什么好办法？
问题二，western里有磷酸化抗体的信号，total蛋白的信号，还有actin的信号，怎么
计算磷酸化信号的强弱？
谢谢！ |
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g*********3
发帖数: 177 | 23 最近做了一个蛋白的transient transfection，在HepG2中表达的，有两个标签His6,
Flag.
用His6做，通过和Negative (untranfected cell)比对，还能找到表达的特异性条带。
用了Sigma的Flag M2 mouse做，保守估计几十条带。。。
不是说sigma的M2很好用吗，做了几次都这样。
大家能否推荐个好用点的Flag抗体，不介意flag-HRP conjugated的。
谢谢！ |
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r***e
发帖数: 2539 | 24 不要用film就没有问题，买一套western成像系统，GE的不贵，based on HRP，挺好用，
Biorad的比较贵。
不喜欢那种二抗带荧光的系统。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 25 你说的那个gel free的western system是指SIMON吧？ 死贵死贵，而且目前的model是
用HRP化学荧光来读数，所以一次只能用一个抗体，没有办法直接在同一个样品上跑内
参看loading,也没有办法同时看不同的蛋白。如果他们搞成多色的系统，我还可以勉强
考虑买一个。现在的状况我是根本不考虑。
experion |
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i***l
发帖数: 1656 | 26 1014992
qiagen penta His HRP , 125ul/vial , forgot the price
good |
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t**l
发帖数: 109 | 27 用biotin-conjugate 或者HRP-conjugate 的抗体做WB |
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d**b
发帖数: 1286 | 28 房子不要很大，但是要一个很大的地下室，干什么用，待会儿再说。
大理石地砖，波斯羊毛地毯，法国的桌子，意大利的椅子，此类物品一概杜绝，墙面，
地面，桌面，全采用PFA材料，耐酸耐碱耐高温易清扫，不用担心污渍，脏了，盐酸，
烧碱，双氧水，换着泼，刷完了，用自来水洗15遍，蒸馏水洗5遍，超纯水洗3遍。（当
然是花钱雇人刷，小姐我养细胞刷的瓶子表面积加起来都铺N间房的地板了，看见国产
玻璃细胞培养瓶就感觉吃了一口臭鸭蛋。）
德国schott的试剂瓶，大中小买全套，500mL的拿来喝茶，2L的插花，100mL以下的是佐
料瓶，密封好，定量超准，还耐热冲击（这点是我最欣赏的，非常精准的工艺。国产玻
璃器皿，热冲击很容易就爆裂，拿去灭菌，十个有八个拿出来是碎的。）
玻璃的觉得重，还可以用硅化塑料的，防水不吸附，不用刷子也能洗干净。
METTLER TOLEDO的电子天平，称佐料的。
Eppendorf的移液枪，Axygen的吸头，当然是炒菜时用来加酱油和料酒的，用汤勺多不
准阿，还容易撒出来。
洗碗，安利洗洁精多土啊，sigma进口分装的NP40，triton X-100，triton X-114和... 阅读全帖 |
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z****u
发帖数: 1007 | 29 你你的probe是conjugate的什么的，ALPase? biotin? HRP? fluorescence? 如果是
ALPase, 也许有内源性的ALPase. 这种情况你一样可以看到信号。但background会很
高。
ISH这技术相当tricky.事先的optimization极其重要，不然啥结果都有可能出来。我现
在是能不做ISH就不做。tissue的ISH对我们来说是标准. 看起来你做得是cell. |
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L****T
发帖数: 169 | 30 传统的HRP-ECL曝光条带强度不是线性的，不是同一次曝光的胶片还真不大好定量。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 31 自己恬不知耻重新粘贴复制一遍吧，哈哈
酵母有两种寿命，replicative lifespan 和 chronological lifespan，不能分裂了表
示replicative lifespan 终止，但是酵母在不能分裂了之后还能活一段时间，有点类
似人的衰老和生殖。
对单个细胞来说端粒很重要，但是很多生物，老年体的细胞提取出来还能分裂十几次还
是几十次，说明细胞分裂能力并不是最终诱因，包括干细胞的保持，不光跟本身分裂能
力有关，跟其所处的niche也有很大关系。
包括c elegans里面如果过表达telomere-binding protein HRP-1可以延长端粒和寿命
，但是因为线虫体细胞不再分裂，所以端粒酶很可能确实是对衰老有影响，但是应该是
通过其他途径（比如oxidative stress神马的，paper没有细看）而不是通过维持细胞
的正常分裂能力来影响衰老。如果承认衰老是进化上普遍存在的现象，c elegans这个
例子就很有说服力。
老鼠里面有两篇关于telomerase改善老鼠衰老的症状等等的文章一篇在cancer
resistant的模型里面（否则te... 阅读全帖 |
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A*******e
发帖数: 284 | 32 请问有无人用过FITC偶联的一抗做过western，做完后直接让typhoon扫膜成像。不用用
AP或HRP，如果能直接扫就很方便 |
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d****i
发帖数: 2346 | 33
Odyssey很好用，但是现在好像没有好的strip办法，一张膜用了再重复杂交的余地不多
，没有HRP能杂交“无数”蛋白。各有优点吧，我只是不喜欢钻到暗室里。 |
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b*****n
发帖数: 1841 | 34 Tyramide Signal Amplification Kits有的是二抗直接连HRP，有的又加了中间一步，
就是streptavidin和Biotin相结合，后者是一对一的关系，又没有放大信号，那么加这
么一步目的何在呢？ |
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w********h
发帖数: 12367 | 35 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: bulletin (bulletin), 信区: Biology
标 题: 穷人的劳斯莱斯——五年western经验谈（转）
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Mar 2 23:29:05 2012, 美东)
1. 抗体的选择
对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很
简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区
的实验者而言，感触尤深。在 这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗
体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。
进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），
而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的 价最贵；比较有性价比的是CST的
抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没
有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验，还有一个优点是
通常量比100微升多出来10... 阅读全帖 |
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N***i
发帖数: 2063 | 36 Best-Rated Financial Stocks Updated June 23, 2010
http://www.nasd100.com/2010/06/bestrated-financial-stocks-updated-june-23-2010.html
Ranking | Company (Ticker) | Average Rating Value | Average Rating
1 IRSA Inversiones Representaciones (ADR) (NYSE:IRS) 1.00 Strong Buy
2 Primus Guaranty, Ltd. (NYSE:PRS) 1.00 Strong Buy
3 China Life Insurance Company Ltd. (ADR) (NYSE:LFC) 1.00 Strong Buy
4 National Bank of Greece (ADR) (NYSE:NBG) 1.00 Strong Buy
5 HDFC Bank Limited (ADR) (NYSE:HDB) 1.00 ... 阅读全帖 |
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