t******n
发帖数: 2939 | 1 ☆─────────────────────────────────────☆
thirdman (三蛮子) 于 (Tue Nov 8 23:02:07 2011, 美东) 提到:
RT，感恩节包子楼~
由于今天发帖有点晚了，今天奖励前十，9日之后按照原帖规则来~~~
看你们的回帖，都不符合要求啊。。。。。。
给你们次机会，零点前改过来的依然有包子，不改的就不要怪吃不到包子了；；；；；
活动介绍帖内容如下：
RT，还没出炉~
再过几天就是感恩节了，在感恩节来临之际发包子
这次规则有些不一样，活动从今时今日此点开始，活动时间持续到2011年11月24日零点
（东部时间），即为星期四的零点（星期三晚上零点），活动有两项
第一项：纯包子
---------------------------------------
从即日起开启包子楼，所有抢包子的朋友们请在包子楼抢包子~
规则如下（均要满足以下所有条件，so，抢包子前注意看规则啊）：
1、话说感恩节起初就是为了庆祝丰收而来，那么，回帖必有一些自己的收获~~
2、“君子日参省乎己”，借着感恩的名义表达下自己的感恩之情
3、第一项和... 阅读全帖 |
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t******n
发帖数: 2939 | 2 ☆─────────────────────────────────────☆
Lashandru (拉山猪) 于 (Mon Apr 9 15:17:10 2012, 美东) 提到:
我是“弹劾”，我内心是有多阴暗啊。。。
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NewCutie (牛裤贴) 于 (Mon Apr 9 15:18:10 2012, 美东) 提到:
图和
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zzyzzy (Zhang) 于 (Mon Apr 9 15:34:52 2012, 美东) 提到:
田禾
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Milstein (It's a wonderful life) 于 (Mon Apr 9 16:32:41 2012, 美东) 提到:
调和
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RedDragon (红龙) 于 (M... 阅读全帖 |
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t******n
发帖数: 2939 | 3 ☆─────────────────────────────────────☆
johny (猴年马月) 于 (Fri Jul 19 22:38:19 2013, 美东) 提到:
去年九月的最后一天，被上一个公司给开了，垂头丧气收拾东西，一切弄利索已经是晚
上10点过了，当时我一个人住在离公司比较近（大概走路二十分钟）的公寓里面，老婆
孩子在另一个州，平常都是步行上下班。
收拾完东西，抱着我的盒子出了公司大门，走过停车场，公司一个见过一两面（但不熟
）的清洁工黑大叔远远地看到我，跟我打了个招呼，并问我要不要搭车？我怕麻烦他，
便说不用了。哪料到大叔直接把车发动，开到我旁边，叫我上车，说这么晚走路不安全
。大叔是好心，其实公司所在的那个小城市还是相当安全的，即使在夜里，不过也可能
我呆得时间不够久的缘故，看到听到的还不够多的原因吧。
想了一想，就上车了。大叔问我咋弄得这么晚才回去，我告诉他被公司开了，他好言相
劝，叫我想开些，说还是安全第一，不论怎样都尽量避免走夜路。正说着，对面路上有
个黑人小青年经过，大叔说这些人就很危险，夜里遇到很大可能被抢。
又过了一会儿，到了我住的公寓... 阅读全帖 |
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c****n
发帖数: 15245 | 4 房子不要很大，但是要一个很大的地下室，干什么用，待会儿再说。 大理石地砖，波
斯羊毛地毯，法国的桌子，意大利的椅子，此类物品一概杜绝，墙面，地面，桌面，全
采用PFA材料，耐酸耐碱耐高温易清扫，不用担心污渍，脏了，盐酸，烧碱，双氧水，
换着泼，刷完了，用自来水洗15遍，蒸馏水洗5遍，超纯水洗3遍。（当然是花钱雇人刷
，小姐我养细胞刷的瓶子表面积加起来都铺N 间房的地板了，看见国产玻璃细胞培养瓶
就感觉吃了一口臭鸭蛋。）
德国schott的试剂瓶，大中小买全套，500mL的拿来喝茶，2L的插花，100mL
以下的是佐料瓶，密封好，定量超准，还耐热冲击（这点是我最欣赏的，非常精准的工
艺。国产玻璃器皿，热冲击很容易就爆裂，拿去灭菌，十个有八个拿出来是碎的。）玻
璃的觉得重，还可以用硅化塑料的，防水不吸附，不用刷子也能洗干净。
METTLER TOLEDO的电子天平，称佐料的。Eppendorf的移液枪，Axygen的吸头
，当然是炒菜时用来加酱油和料酒的，用汤勺多不准阿，还容易撒出来。洗碗，安利洗
洁精多土啊，sigma进口分装的NP40,triton ... 阅读全帖 |
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r****1
发帖数: 2299 | 5 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: platinumegg (蛋,纯铂金的), 信区: Biology
标 题: 生物学男的一个梦（转自开心） (转载)
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Nov 12 12:42:07 2010, 美东)
发信人: cdlqin (cdlqin), 信区: Joke
标 题: 生物学男的一个梦（转自开心）
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Nov 12 09:00:09 2010, 美东)
房子不要很大，但是要一个很大的地下室，干什么用，待会儿再说。 大理石地砖，波
斯羊毛地毯，法国的桌子，意大利的椅子，此类物品一概杜绝，墙面，地面，桌面，全
采用PFA材料，耐酸耐碱耐高温易清扫，不用担心污渍，脏了，盐酸，烧碱，双氧水，
换着泼，刷完了，用自来水洗15遍，蒸馏水洗5遍，超纯水洗3遍。（当然是花钱雇人刷
，小姐我养细胞刷的瓶子表面积加起来都铺N 间房的地板了，看见国产玻璃细胞培养瓶
就感觉吃了一口臭鸭蛋。）
德国schott的试剂瓶，大中小买全套，500mL的拿来喝茶，2L的插花，100mL
以下... 阅读全帖 |
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r****o
发帖数: 105 | 6 可以是可以，但是没有什么意义。因为最后拿到的片子，没有办法分辨那条带
是由哪个抗体识别。所以，还不如同时跑三组，然后平行用三种一抗做。或者
一个BLOT，洗脱前一个抗体后再做第二种.
我能想到的唯一一种用不同抗体的办法是最近的一种新技术，荧光Western.
具体就是说，二抗不联HRP而是联一个荧光生色集团，用近红外光照射后就会发射
荧光。然后有特殊机器扫描记录。由於不同生色团发光颜色不一样，可以同时
展示同时区分两种带有不同TAG的蛋白。 |
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m**o
发帖数: 13 | 7 I don't quite understand how you label the probe. Usually the methods for
making non-radioactive probe incorporate only a small unit, like a biotin,Dig
or fluorescein into the probe via UTP or others instead of directly incorporate
the enzymes for detection,like HRP, AP. Since it is not easy to keep the full
enzymetic activity during the long experiment procedure.
So if you use klenow to label the probe, you can deactivate the klenow by
heating the reaction at 75C for 20min in presence of 10mM E |
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p**i
发帖数: 3525 | 8 for chicken IgY
Many thanks! |
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n**********1
发帖数: 251 | 9 使用Odyssey，是不是二抗要是荧光的，普通的HRP好像不行吧。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 10 你应该是记错了。tween20会干扰一些抗体的结合，在某些情况下会降低特异信号。
当然大部分情况下是无所谓的。
如果是用HRP, NaN3是绝对不可以用的。不过Licor就无所谓了。
我刚才查了一下google, Maleic acid 的确是抗菌剂，和背景没有太大关系。 |
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S*****s
发帖数: 287 | 11 如果你说的是膜和二抗的话价格和普通 HRP based western 差不多，不过它不需要显
色剂，Ladder 的用量也比普通的 Dual color ladder 少，综合下来花费还便宜一点。
这个系统最大的优势是可以把两个不同 species 的抗体放在一张膜上染色，如果抗体
选的适当，一张 Odyssey 膜等于是两张 ECL 膜的结果，试剂花费就少很多了。我上
个月跑了三十块胶，多个抗体同时染色然后用 Odyssey 看结果，得到的数据量起码等
于用 ECL 跑五十块胶。 |
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y**y
发帖数: 36 | 12 现在有HRP （brown） and AKP(blue to purple) double staining IHC
为什么IF不行？ |
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j*z
发帖数: 6 | 13 Thank you so much. I am planning to try HRP/DAB + AP/New Fuchsin. |
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w******e
发帖数: 1187 | 14 用HRP，好像有多种substrate可用，不知有没有讲究？比如哪种显色
快，哪种linear range/dynamic range比较大之类？
多谢！ |
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g*****y
发帖数: 6325 | 15 我大学的时候用过hrp－tagged. 效果挺好。忘了是什么公司的了。 southern不用同位
素的应该没问题。 northern 一般是一定要用同位素的。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 16 一直用HRP－ABTS做ELISA，antibody signal强用的挺好。最近做aptamer
based ELISA，经常要develop1、2个小时，很是郁闷。请问有没有signal
amplification比较强劲的enzyme-substrate pair，产物是fluorescent
也行。//bow |
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b******c
发帖数: 38 | 17 Dear All:
I am having a hard time to pick a 2nd antibody for Western blot. Does any
one know any good anti-goat secondary antibody?
Thank you very much! |
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O******e
发帖数: 4845 | 18 We are using Bio-Rad's. It is working well. |
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f***h
发帖数: 485 | 20 I tried GE healthcare and cell signaling. Both are good |
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b******c
发帖数: 38 | 21 Thanks! There are so many of them. Would you mind telling me the catalogue
number of the one you guys are using? I'll really appreciate it |
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b******c
发帖数: 38 | 22 Would you mind letting me know their catalogue numbers please?
Thank you very much! |
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h*******o
发帖数: 4884 | 23 NaN3 does interfere with HRP conjugated 2nd secondary antibody.
But it is in primary antibody, with enough washing between primary and 2nd
antibody, it should be OK.
I don't recommend use antibody older than 3 months in diluted solutions, who
knows what could happen. Especially when your samples are precious, I would
rather use something that's safe and predictable.
By the way, antibodies are not expensive at all if they actually work.
I would rather spend more money on a reliable vendor than wa... 阅读全帖 |
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p*********g
发帖数: 9527 | 24 【 以下文字转载自 Joke 讨论区 】
发信人: cdlqin (cdlqin), 信区: Joke
标 题: 生物学男的一个梦（转自开心）
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Nov 12 09:00:09 2010, 美东)
房子不要很大，但是要一个很大的地下室，干什么用，待会儿再说。 大理石地砖，波
斯羊毛地毯，法国的桌子，意大利的椅子，此类物品一概杜绝，墙面，地面，桌面，全
采用PFA材料，耐酸耐碱耐高温易清扫，不用担心污渍，脏了，盐酸，烧碱，双氧水，
换着泼，刷完了，用自来水洗15遍，蒸馏水洗5遍，超纯水洗3遍。（当然是花钱雇人刷
，小姐我养细胞刷的瓶子表面积加起来都铺N 间房的地板了，看见国产玻璃细胞培养瓶
就感觉吃了一口臭鸭蛋。）
德国schott的试剂瓶，大中小买全套，500mL的拿来喝茶，2L的插花，100mL
以下的是佐料瓶，密封好，定量超准，还耐热冲击（这点是我最欣赏的，非常精准的工
艺。国产玻璃器皿，热冲击很容易就爆裂，拿去灭菌，十个有八个拿出来是碎的。）玻
璃的觉得重，还可以用硅化塑料的，防水不吸附，不用刷子也能洗干净。
... 阅读全帖 |
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I*****y
发帖数: 6402 | 25 ECL用的二抗有HRP酶，而Odyssey用的二抗是有荧光的。这个灵敏度应该是有差异的，
不过我不确定Odyssey的灵敏度是否差一些
带， |
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C*******e
发帖数: 4348 | 26 rt
用于WB，检测his-tag fusion protein
最好是已经HRP conjugated
如果不是的话最好是rabbit的
实验室用的是qiagen的kit里的一管
不单卖
以前用过santa cruz的
rabbit的，还要加二抗
多谢啦 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 27 想要rabbit的，或者HRP conjugated的
你说的那个是mouse的 |
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s******y
发帖数: 28562 | 28 Qiagen Penta-His-HRP 还可以 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 30 AP不如HRP敏感
不过AP不需要用底片或者特殊的image system，用BCIP/NBT显色肉眼就看到了 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 32 Tris有点细胞毒性，所以活细胞是用PBS的；Phosphate对某些酶活性有干扰
～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～
话说WB都已经是变性的蛋白了
有没有细胞毒性谁care啊
而且变性蛋白有没有酶活性也无所谓了
phosphate对WB最后一步AP或者HRP的活性没有干扰就结了
phosphate常规chemical，也不是多贵的东西 |
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s******e
发帖数: 370 | 33 可以。我以前的实验室就是用western的HRP抗体
不过我现在是用Roche推荐的AP＋CSPG |
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s******n
发帖数: 63 | 34 就是CST的HRP-Goat啊，用来识别Goat IgG。本来想用Trueblot的Goat二抗，信号太弱
，就还是用了普通的Goat二抗 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 35 你一抗用的什么比例稀释？
我按照说明用的1/2000
二抗是HRP的，用的1/10000
虽然说WB需要optimization
但是像这种his-tag，GST-tag之类的买的到的常用抗体
不是应该很straight forward才对么
要不然谁买啊
AP |
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d****i
发帖数: 2346 | 36 我们现在在用b-actin。
同时想试试看b-tubulin和GAPDH，请大家推荐好用的抗体。不要偶联HRP等的。
非常感谢！ |
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h*******o
发帖数: 4884 | 37 sodium Azide at low concentration mainly interferes with the peroxide
reaction (HRP conjugated 2nd antibody). It should be fine to use at a very
low concentration.
After all, it is all up to the antibody. For b-actin, sure freeze and thaw
is fine.
For some delicate antibodies, it will be a big problem.
So for me, unless it is extremely hard to get the antibody, I woudn't reuse
for more than 5 times, usually 3 times. |
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s********n
发帖数: 248 | 38 我用过cell signaling 的pAKT T308,这个克隆是最好的
http://www.cellsignal.com/products/2965.html
block 用5%milk/PBST (0.02% TWEEN 20), dilute primary antibody in either 5%
milk or 5%BSA/PBST, 4 degree overnight.
quick wash 2/3 times, then wash 3 times*5 min with PBST,
dilute 2nd antibody (JACKSON LAB HRP-GOAT anti-Rabbit light chain) 1:2500 in 5%MILK/PBST
(如果杂带多，需要把二抗稀释在5%milk里), RT for 1h; 如果杂带不多，可以稀释1:
15000 in PBST, RT for 45min。
quick wash 2/3 times, then wash 5 times*5 min with PBST. |
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l******o
发帖数: 62 | 39 有谁用过荧光2抗做WB, 跟HRP conjugated 的优缺点? |
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c********b
发帖数: 363 | 40 比较好奇的问（也包括问楼上各位）所谓不行是指没有带还是杂带很多？
我主要做的植物，很多植物都有各种各样的辣根过氧化物酶，象烟草在32Kd的地方什么
抗体都不加，用pierce的HRP的底物反应，曝光1分钟肯定有带。坑了我2年多。 |
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c********b
发帖数: 363 | 41 比较好奇的问（也包括问楼上各位）所谓不行是指没有带还是杂带很多？
我主要做的植物，很多植物都有各种各样的辣根过氧化物酶，象烟草在32Kd的地方什么
抗体都不加，用pierce的HRP的底物反应，曝光1分钟肯定有带。坑了我2年多。 |
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v**********m
发帖数: 5516 | 42 上的量太大，HRP很快就将底物反应完，所以就空心了。那些黄色的条带就是反应完了的底物。
少上点样试试，另外刚加完底物就上照相机，分别拍15， 30, 60, 120 sec的照片。 |
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r******y
发帖数: 21907 | 43 最好是monoclonal的 polyclonal的也可以接受了 |
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c********b
发帖数: 363 | 45 MONOCLONAL ANTI-HA
PEROXIDASE CONJUGATE
CLONE HA-7
Product Number H 6533
试过IP和WB，都很赞。 |
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c********b
发帖数: 363 | 46 不要用二抗，用protein a-hrp会好些 |
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r***n
发帖数: 52 | 47 Thanks for your help. Actually, I'm not using isotope to label protein.It's
isotype for antibody control. Because all of papers published with IP
results showed IgG control, which is supposed to be no band of target. But
mine has the same band intensity as IP ones but wash off some after long
time incubation with TBST and detected by another species HRP.
- cellular tyrosine-
Immunoprecipitation positively
experiments |
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r***n
发帖数: 52 | 48 Thanks for your help. Actually, I'm not using isotope to label protein.It's
isotype for antibody control. Because all of papers published with IP
results showed IgG control, which is supposed to be no band of target. But
mine has the same band intensity as IP ones but wash off some after long
time incubation with TBST and detected by another species HRP.
- cellular tyrosine-
Immunoprecipitation positively
experiments |
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b******n
发帖数: 4225 | 49 1. 抗体的选择
对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很
简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区
的实验者而言，感触尤深。在 这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗
体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。
进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），
而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的 价最贵；比较有性价比的是CST的
抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没
有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验，还有一个优点是
通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗
体质量可以，但是选用 Santa的单抗还是有风险，估计这也是业界共识了吧。
进口抗体国内分装包装我也用过不少，呵呵，毕竟是穷人（420元/100微升），大概好
抗体的比例约为50%，如果能做出来，也存在一个问题，就是... 阅读全帖 |
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i****g
发帖数: 3896 | 50 写得比较有意思，但是不太实用，可能实验条件相差太大。precast gel比自己制的gel
效果要好很多，结果也容易重复。antibody要看运气的，呵呵。
1. 抗体的选择
对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很
简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区
的实验者而言，感触尤深。在 这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗
体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。
进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），
而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的 价最贵；比较有性价比的是CST的
抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没
有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验，还有一个优点是
通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗
体质量可以，但是选用 Santa的单抗还是有风险，估计这... 阅读全帖 |
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