j****1
发帖数: 81 | 1 Here is another abstract, because I have to write two abstracts for my
qualifying exam.
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Not only are neural stem cells important in learning and memory, they are
also potential therapeutic approaches for neurodegenerative and other neural
pathological diseases. Adult neurogenesis occurs in the subventricular zone
(SVZ) of the lateral ventricle and subgranular zone (SGZ) in the
hippocampus (Suh et al., 2009... 阅读全帖 |
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D*a
发帖数: 6830 | 2 cre刚切完还有蛋白也是可能的。flox/flox我觉得不影响cre的效率的，cre好用的话一
个两个都无所谓，不好用的话就是不好用了。
你做oocyte 的 genotype了么，是什么结果？直接上staining看蛋白了？当然oocyte
特异PCR不好做，但是你自己想办法看见带吧。
如果cre f/f的母老鼠跟+/- 公老鼠交配，后代应该是一半纯和致死的，你观察到了么？
你现在的信息说这个cre好用不好用都太早。 |
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j*********o
发帖数: 237 | 3 那就是cre效率问题，没有人能保证100%切除，况且还有其他细胞类型干扰，可以根据
genotyping被切掉的带和没被切掉的带的比例估计一下效率。这种情况western也不靠
谱，上免疫荧光，和肝细胞marker共染，看看有多少细胞被KO了。
对了，你确定你的老鼠尾巴上是flox/flox吧？ |
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z****u
发帖数: 1007 | 4 Mx1-Cre是个inducible cre line. 需要interefon 诱导才有cre 活性。 理论讲homo是
正常的无phenotype. 所以一般来说你可以直接generate Mx1-Cre; flox/flox line,
并用其传代，这样比例高很多。 |
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t******k
发帖数: 599 | 7 关于creERT2有一个问题想不通，如果不给tamoxifen，而只是转染一个flox-stop-flox
-gfp到细胞质里，那这个creert2可以起作用让gfp表达么？ |
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z****u
发帖数: 1007 | 8 稍等。。还有个简单的模型
X-CreERT;Tdtomato flox;rtTA flox;tetO-H2BGFP 后面三个strain在JAX都有
不过这个模型好像只能证明X+ stem cell是quiescent。也许可以拿来检测在某些病理
条件下quiescent stem cell有没有 quiescence loss |
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x********e
发帖数: 35261 | 9 Cre, LSL-KD/+没表型应该是fertile的吧？把这个line跟floxed WT line cross，得到
Cre, LSL-KD/floxed WT。如果用合适的Cre，能否得到KD/-？ |
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t******k
发帖数: 599 | 10 我有一个line是cre-ert2 A／gfp reporter。现在需要cre－ert2 B／gfp reporter／
floxed gene。因为lab里已经没有gfp reporter老鼠，那我可以genotyping cre-ert2
A／gfp reporter，用cre-ert2 A negative／gfp reporter的老鼠去和cre－ert2 B／
floxed gene直接cross么？所有老鼠都是b6 background，那我还需要考虑cre-ert2 A
／gfp reporter会有background问题么？ |
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w*****n
发帖数: 107 | 11 我遇到过和你类似的情况，不过是我找别人要老鼠。对方给了，但是要authorship, 我
觉得reasonable.
"thanks very much for your note. We would be happy to send you the mice,
which have been thoroughly backcrossed on a C57Bl6 background. As you may
remember from the paper, they get pretty sick and don't breed as homozygotes
. An alternative might be the floxed allele, which we also have, and you
are welcome to. In general, we ask to be offered co-authorship on papers
using the mice, which I hope is not too onerous." |
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x******n
发帖数: 8550 | 12 turf lily
hosta
ground covers such as creeping thyme, creeping flox
flowers may bloom for just a short season, a few weeks or up to 2-3 months.
it's better to pick sth for the shape/color of the leaves.
the coverage is important too. better choose sth you've seen in person. |
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r****a
发帖数: 3304 | 13 garden flox in the middle of garden, flowering from summer to fall
or coneflower, blackeyed susan |
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x******n
发帖数: 8550 | 14 赞白色的脱俗，白色的flox和其它颜色种一起会非常好。
你的邻居白色花园怎么样了？有没有去看看加拍几张？ |
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n********k
发帖数: 2818 | 15 Finally u came:)))...I also have a question in this case, so will the
efficiency of desired targeting much lower, or
not really with your experience... Another question is what if the middle
fragment is like 10kb or even more....I
was thinking it would take two recombination events to get them in...then
the efficiency would be really low...
recombination
may
maximize
floxed |
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S******9
发帖数: 2837 | 16 你这个beta-actin Cre是non inducible的？
我们组研究的target基因就是在胚胎11.5～12.5天的时候死掉。即使是Tie2 Cre内皮特
异性的也是的。所以我们研究的成鼠是用的beta-actin Cre是inducible的，可惜我们
的flox做的不是特别好，有leaky现象，部分老鼠实际出生的时候已经有很大的ko了，
当然用药物诱导以后可以ko掉90%。
叫你老板把我招去吧，我喜欢做老鼠model的活。做atherosclerosis，vasoactivity，
原代血管内皮培养，各种组织切片染色。 |
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j*****d
发帖数: 787 | 17 depends on what to be co-cultured.
so cre/flox models in mouse are very powerful. |
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r***e
发帖数: 2539 | 18 我想绝大多数情况下hetero足够了，但我做过一个primary cell culture subclone，大
多数细胞是-/-,但的确发现一些是flox/-，就是说切了一个allele，应该和cre promot
er的强度有关。 |
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M*****e
发帖数: 279 | 19 我遇到过。
一窝只有一个Male，其余都是Female。
另一窝，没有Male，都是Female。
再一窝，有两个Male，其余都是Female。
老鼠不是KO，只是hemizygous (one allele floxed beta-catenin and one allele
Cre). 后来这个实验终止了。没钱了。 |
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w*e
发帖数: 740 | 20 简单说就是VECTOR 长短臂与目的基因发生同源重组时候，随基出现的不是很精确的替
换，本来的基因还是在的，我觉得类似SANGER公司现在高通量制造FLOX老鼠的 GENE
TRAP有点类似，具体你可以参考GENE TARGETING这本书，（红色的哪个，里面说的很详
细） |
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D*a
发帖数: 6830 | 21 不用非用母的吧，公的母的都会被KO的
你试试加量呢？
我们实验室有人做的，量具体不知道，是早晚各一次持续五天，他们第一次摸的时候弄
了三种不同浓度不同长度的protocol来实验。
另外你的cre真的管用吗？我们隔壁实验室也用cre在另一个器官做ko，我们用的是同一
只flox的老鼠，他们的就效率很低 |
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a*******g
发帖数: 33 | 22 辛辛苦苦弄了一年，打算在老鼠身上用lysM-Cre敲除一个floxed的基因，结果酶活
性没怎么变化，蛋白含量变化也不到50％，mRNA倒是减少了80－90％。我觉得是很失败
，没法继续干下去了。可是老板一直不接受失败。即便失败，也要我去探讨为什么失败。
博士刚开始，碰到这种事，大家说说该怎么办呢？ |
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k***u
发帖数: 176 | 23 两个floxed allel的话加上一个KO 试试
败。 |
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S******9
发帖数: 2837 | 24 you need use double LysCre flox.
one cre only delete 40%~60%, double 90~96% |
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Z**********g
发帖数: 222 | 25 一种可能是部分细胞被ko了,部分细胞没被ko,而你检测mRNA/蛋白/活性的时候,样品包
括了ko和没ko的细胞.另外一种情况是所有细胞只被ko了一个allele,另一个allele是wt
,也导致这种结果.所以要么该cre活性不够强,要么该cre在这群细胞中不均一表达.一个方
法是你可以把你的Cre;gene f/f的小鼠与GFP flox小鼠杂交,看看GFP的表达情况,同时
把GFP阳性的细胞FACS sorting出来,再检测mRNA/蛋白/活性. |
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D*a
发帖数: 6830 | 26 听老板说过一个很悲催的案例
千辛万苦做了一个flox的老鼠，测序什么的都没问题，跟cre交配，死活不KO，折腾了
好半天，终于发现loxP被甲基化了。。。。。。 |
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i*****n
发帖数: 53 | 27 breed to reporter mice 才是正解。 比如有一种老鼠 在LacZ 之前有 floxed stop
codon. |
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w**f
发帖数: 38 | 28 有没有做breast cancer的同学？我正在找MMTV-Cre和WAP-Cre (both in FVB
background). Do you know where to get them and the best one that I can use (
JAX does not have)? I want to delete floxed gene in mammary gland. thanks a
lot. |
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D*a
发帖数: 6830 | 29 1. take forbrain, extract genome, quantitative PCR
2 anti 目标蛋白 和 anti Cre antibody是我正想做的，见有paper做过，我们实验室
没有先例，尤其我们是膜蛋白更难搞。尤其是anti Cre antibody，版上用过的也告诉
我一声吧。
3 可以用cre杂交mice with reporter gene，比如lac z或者 某FP。 |
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p***i
发帖数: 96 | 30 但是我听说cre的recombination的效率最多只有60%， 请问是这样吗？如果是的话，那
么cre homo是否应该比册cre hetero更高效呢？
谢谢 |
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D*a
发帖数: 6830 | 33 因为一般来说cre在基因组里面是瞎插的，有破坏其他基因功能的可能性。所以
hemizygote没事，但是homo的cre，有可能就会有phenotype了。 |
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s*********g
发帖数: 68 | 35 how to know if the Cre is homo or hetero. My understanding is that Cre is
randomly inserted in genome even potentially with multiple copies.
Is really a way to know if it is hetero or homo? |
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D*a
发帖数: 6830 | 36 homo or hetero是指是不是占据等位基因的两个位点，跟copy数没关系。主要是cre的
插入是否破坏其他基因的问题，跟cre的毒性是两个概念。 |
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v****e
发帖数: 131 | 37 问大家一个问题.
我知道senescence associated beta-gal staining 是最常见的方法检测senescence是
否发生了改变.可不幸的是我们的flox老鼠在构建的时候插入了beta-gal基因.所以当我
们基因被knockout后,beta-gal就会表达.我们平时用普通beta-gal staining 这个来
trace deletion effeciency and etc.
我的问题是还能用senescence associated beta-gal staining (SA-b-gal) 来检测
senescence是否发生了变化?注意到SA-b-gal staining的ph值要求是6.我们平时做的
staining是ph 7.其它步骤都是一样的.是不是可能这个ph的一点不同,能够使我们老鼠
中依然可以做senescence associated beta-gal staining.
anyway,我还是可以做western 检测marker.据我所知有PAI-1,P21,P53,P19.我发现P19,
PAI-1改变,但P53不变,mak... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 38 Exactly,
Please go to
//www.biotechniques.com/multimedia/archive/00010/01315rr05_10077a.pdf
it shown that complete genotyping of a floxed locus is possible with three appropriately placed primers
and that this triplex PCR can be performed simulta- neously with a universal PCR assay for the detection of
Cre transgenes.
[回复]
[ 8 ]
发信人: robin95 (robin95), 信区: Biology
标 题: Re: 请教用REAL－TIME PCR 测定基因KNOCKOUT 小鼠是－／－ 还
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Feb 16 11:31:37 2012, 美东)
>非常感谢啊， 那就是说要３个PRIMER 一起加， 而不是像普通PCR 那... 阅读全帖 |
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D*a
发帖数: 6830 | 39 中间那个蓝的你也可以跟红的配对，把它反过来设计。这个看你的基因组序列了。必须
要三个引物的退火温度差不多才能都放到一起用。
我们还再加几对其他的引物测其他的transgene，比如cre啥的，也都放到一个program
里面，一次PCR就都有了。
flox啥的你要是不知道自己查查吧。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 41 顶贴跟车问一下
要稳转一个不带抗性的plasmid到mES cell
请问可以通过共转一个带抗性plasmid的方法来转么？ 做过的同学说一下？ 两个质粒
的ratio要怎么调？经验上两个一起定位到一个的情况多么？ |
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z****u
发帖数: 1007 | 42 做过。不过这个真的是因鼠而异，因line而异。 新生的打药很容易死的，觉得好多其
实就是给针扎死的，所以我都拿滴管来喂。
几周前才做了一个DTA flox driven by Cre-ERT的诱导ablation实验，效果还是很明显
的。每天给4mg剂量的成鼠，一周后都死翘了。因为target的范围太广了。不过我所感
兴趣的组织里面大量的死亡组织能被看到。确实如预期。 |
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m******n
发帖数: 121 | 43 感觉是用纯合的cre老鼠去杂交，但是查到的手册里面介绍的是用杂合的，而且这些cre
老鼠别人给我的时候也是杂合的。。。于是就不懂了，求指导～～～～ |
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l******n
发帖数: 298 | 44 most of the time, cre+/- is OK |
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D*a
发帖数: 6830 | 45 很多cre line大家都不知道插到哪里了，所以想做纯合子有点麻烦，一般自己养都是杂
合养。
另外杂合的交出来一半是littermate的control正好。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 47 Hongkui Zeng的TdTomato flox. 确实很强，我们建了个全身敲除的positive对照系，
大白天老鼠都是红的，都不用做genotyping。 |
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j****3
发帖数: 48 | 48 实验室有floxed的老鼠，打算注射Adnovirus给Cre recombinase...从一家公司买了一
个Ad-Cre,是有CMV promoter的，已经感染了HEK293细胞，收了细胞后（还没提纯），
现在想先看看病毒带的Cre序列有没有表达。跑了PCR可以看到带，但是WESTERN BLOT(
把HEK细胞裂解在RIPA buffer)用抗体却找不到Cre蛋白.咋回事呢？从没和病毒打过交
道，如果问的太傻，请尽量拍砖。。多谢 |
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D*a
发帖数: 6830 | 49 以后southern不用切么？
我也没造过老鼠，都是听周围造老鼠的说的。
我们用的floxed的老鼠两个loxp中间800bp左右，exon只有不到400，剩下的400是两边
各一段intron。两边都有几个酶切位点，不过我们的不在 5,UTR，在不在splicing
site就不知道了，从没有任何表型没有蛋白质降低来看应该是不在splicing site。
关键老鼠这玩意儿没见到最后跟cre交配的KO谁也不敢说没问题啊。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 50 一只flox的老鼠跟不同的cre和疾病gene交，做10年也做不完。很多基因的功能其实并
不是那么清晰都发现完了的。我说的做十年也不是说从CNS做到两三分的杂志的那种。
有时候是已经建立了合作了，相同领域的人又来要，就不是做老鼠的人决定给不给了。
我说的合作是做老鼠的人是n作甚至不进作者名单的那种合作。 |
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