s******s
发帖数: 13035 | 1 一个DNA sample, 前面处理比较强 99C啥的，估计有部分或者全部变成ssDNA了
请教两个问题
1. 有什么精确标准的办法确认是不是ssDNA，还是大多数仍然dsDNA
2. 接下来要deep-seq. 我知道可以重新加热慢慢降温重新anneal，或者用
hex nucleotide做prime做一轮PCR，恢复成dsDNA. 请问哪一个方法好一点？
如果后者，应该用什么polymerase, 或者有现成protocol么？ |
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s******s
发帖数: 13035 | 2 谢谢。我想看一下我的DNA里面有多少是ssDNA
另外，什么常用酶只消化ssDNA, 而不是dsDNA (我知道S1, 不过听说量大的时候也
cut两把dsDNA). |
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v*******n
发帖数: 499 | 3 有个问题想请教有经验的大牛
我用biotin pull down enrich 了一些 ssDNA, 想convert成dsDNA， 然后sequence.
有比较成熟一点的方法吗？
好像很多RNA->cDNA->dsDNA的kit我都不能直接用，因为说first strand synthesis 的
时候，那些kit加了一些特殊的adaptor, 然后在second strand synthesis 的时候就很
方便了。但是我ssDNA是直接从linear PCR 来的。不知道有没有什么好方法做second
strand synthesis。
谢谢 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 4 1. 可以跑胶看size吧，DNA ladder是双链的。看你的sample跑得位置和ladder是否一
致。不过如果你的DNA片段太小可能不容易判断。
2. 我觉得重新anneal就好了吧，除非你的ssDNA本身有复杂的二级结构，否则加热退火
之后anneal成dsDNA应该问题不大。重做PCR感觉很多此一举似的。不过我也没有做过类
似的sample处理，不知道实际做起来会不会是影响很大。 |
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s*****t
发帖数: 107 | 5 各位大虾，请问如果用PicoGreen ® dsDNA Reagent 测DNA浓度的话用什么
spectrum meter 读？
多谢 |
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E*********s
发帖数: 93 | 6 我用oligo synthsize 2nd strand. 但是合成后如何才能区别dsDNA 和ssDNA？ 最好是
哪个gel staining reagent 可以直接通过跑gel 就可以知道。谢谢。 |
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q**********0
发帖数: 335 | 7 Anybody use invitrogen "Quant-iT™ DNA Assay Kit, high sensitivity" (
Cat: Q33120) for the quantitation of dsDNA with concentration <10ng.The kit
is quite expensive, not sure whether it is worthy to buy it under the tight
budget.
Thanks. |
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s***e
发帖数: 911 | 9 1. 这个重组过程, 一定是在B-form dsDNA和RecA-ssDNA之间完成的吗?
2. RecA也可以直接和dsDNA作用, 形成dsDNA-RecA triplex. 这个结构在重组过程中有
任何作用吗? 比如, 重组可以不可以在dsDNA-RecA 和一个空的ssDNA之间发生?
3. 重组可不可以在dsDNA-RecA和ssDNA-RecA之间发生?
谢谢. |
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l**********1
发帖数: 5204 | 10 Proposal just:
Oxford nanopore based NGKOT Next Generation Knout Out Technique:
用某种 dsDNA topoisomerase single molecular level cut and relink dsDNA with
magnetic tweezers
NB: NGKOT 能BACbase 300KP 内任意地knoct out 比起20-35 kp Vector的片段内PCR knoct out还是效率高啊
最佳的是可以Knock in again within BACbase 300KP 内任意的 based Oxford nanopore platform.
References:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21809210
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19377505
//en.wikipedia.org/wiki/Topoisomerase
//www.mitbbs.com/article_t1/Biology/31... 阅读全帖 |
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h****n
发帖数: 2552 | 11 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: midwestPstD (中西部博士后), 信区: Biology
标 题: 请教CRISPR行家-HDR Template Design
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Nov 18 16:24:10 2014, 美东)
看了Zhang Feng的Nature Protocol关于CRISPR的文章，Figure 6里面的ssDNA
template明显的效率比plasmid作template高。文章并没有明确说明哪个template好。
想了一下，ssDNA分子量比plasmid小多了，同样的ug template, ssDNA的分子数肯定多
多了，也许这是一个解释。
我自己在设计HDR template，想两边各一个Kb的homologous arm,中间有60-70bp 的
mutation insertion。这个两kb的DNA准备克隆到一个plasmid里面，sequencing确定
mutation后，就可以用作HDR template了。
想请教的是：需要把这个两Kb的template从plasmid里... 阅读全帖 |
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s*k
发帖数: 144 | 12 请允许我这个半瓶醋插两句嘴:-)
大家知道在细菌里染色体是环形的,质粒也是环形的.
那么当它们复制的时候,到了最后关头,就会形成一种
两环互相套在一起的局面. (这个在数学上好象叫knot
我不大敢肯定,希望专家指正) 这时候,正是Topo II
挺身而出,解决了这一尴尬局面,将两个环彻底分离.
ATP若是参与到这个反应,没看文献,按照我的猜测可能
用于断开双链DNA,即形成一个dsDNA-->2ATP的中间体,
以打断DNA.当另一双链DNA穿过dsDNA的断端,酶再将
ATP水解会来,所以整个反应没有ATP的净消耗.
现在教主面临的问题是:
反应既然没有能量的消耗,为什么反应产物却不是处于
统计上的平均分布?
Roca 的工作从酶的作用机理和DNA的超螺旋性上这一
微观角度来解释这一问题.
而教主的工作是从热力学和分子动力学这一宏观角度
解释这一问题.
不知道以上我的这些说法是不是漏洞百出,还请专家斧正. |
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r********s
发帖数: 149 | 13 那看来我们得到了一些实验结果，提出了一个hypothesis,然后再建一个model，也是建
模了？可是，我们根本就不需要什么数学计算。
你用什么生物不都是dsDNA来反驳，有点强词夺理，这个所谓的模型的配对不止是适合
ＤＮＡ的吧，是那些碱基的配对吧？碱基和ＤＮＡ还是不太一样的吧？生物特异性是不
错，可是那是在另外一个层次上的，具体到遗传基因方面，所有的生物几乎都应该是一
样的吧？像这种简单的东西，现在已经被做完了吧，剩下的，你认为还能靠建模来解决
吗？据我所知，从ｗａｔｓｏｎ ａｎｄ ｃｒｉｃｋ后，好像没有哪个生物学家靠建
模来解决一个重要问题吧？现在所谓的建模，只不过是总结已有的一小部分结果，还不
一定用的上。离解决真正的大问题，还差得远。而且，这些大问题能不能被建模，还是
一个问题。
dsDNA的
后 |
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h****6
发帖数: 229 | 14 you may try Phusion or Phire. This polymerase has dsDNA binding domain that
helps to stabilize dsDNA. |
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j********d
发帖数: 157 | 15 Another angle to look at Science vs Engineer:
Science is more of being the 1st - discover sth people never know before (
Newton's princples, genetic DNA, etc).
Engineer is more of optimization (of what we know we can do) to improve
efficiency, reduce cost, etc. Make a airplane, DNA sequencing of plasmid.
In between, as the 1st to do sth that demonstrate it is doable. The first
airplance, the first DNA sequencing of the very first plasmid, etc.
Using DNA as an example, the dsDNA in 1950's w... 阅读全帖 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 16 看了Zhang Feng的Nature Protocol关于CRISPR的文章，Figure 6里面的ssDNA
template明显的效率比plasmid作template高。文章并没有明确说明哪个template好。
想了一下，ssDNA分子量比plasmid小多了，同样的ug template, ssDNA的分子数肯定多
多了，也许这是一个解释。
我自己在设计HDR template，想两边各一个Kb的homologous arm,中间有60-70bp 的
mutation insertion。这个两kb的DNA准备克隆到一个plasmid里面，sequencing确定
mutation后，就可以用作HDR template了。
想请教的是：需要把这个两Kb的template从plasmid里面酶切出来，gel纯化后再和cas9
plasmid一起co-transfect吗？要作ssDNA太难了一点，还没考虑。：（。
很多年前作过ssDNA的transfection（pUC18？phage-ssDNA纯化的)，记得当时发现
ssDNA在真核细胞内不如dsDNA的plasmid稳定... 阅读全帖 |
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R****n
发帖数: 708 | 17 基本上是这样的。似乎要先计算contact map,然后算一下这个蛋白和和几个histone
variant的affinity，我不知道其他还能做些什么。
您能不能写个稍微详细点的pipeline？ 读博士的时候学过一点Pymol,现在估计都忘光
了。
还有几个技术问题：
1）这个蛋白是DNA binding,RCSB上的结晶是施一公做的，那个上边有dsDNA。计算的是
应该去掉dsDNA吧，怎么去掉？
2）这个蛋白和nucleosome wrapping DNA的结合能力，应该需要半放松的DNA双链。
nucleosome的结晶数据是结合比较紧密的。计算怎么模拟？
interface |
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n******s
发帖数: 210 | 18 what about others markers?
like ANA, anti-dsDNA, anti-smith, those are for Dx of SLE.
By the way, only positive is meaningless, titer is more important, normal
person may be positive, but titer is low, most lower than 1:32. |
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n******s
发帖数: 210 | 19 it might be "morning stiffness", if it lasts longer than half an hour, be
careful of SLE, RA or something in that category.
watch photosensitivity, raynoid's sign, oral ulcer, joint pain, esp knees.
fever/chill, rash, etc.
if more than 3-5 are positive, then go to see a doc and do a screening test
like ANA, RF, anti-Sm, anti-dsDNA. |
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c********e
发帖数: 496 | 20 ANA大于1：32，首先看分型，颗粒型或者边缘型，但是有的是有意义的，有的没有，具
体哪个是哪个，忘了，你自己google一下。但是更重要的是看dsDNA antibody， sm
antibody，这个是诊断用的。 看是不是有lupus。
如果确诊有lupus，就不需要做肝穿。 治疗的原则都差不多
有自免溶贫的病史，增加了lupus的可能， 都是免疫系统出问题了/
一般来讲，免疫性肝炎在早期是b超是看不到变化的。
另外，如果最后的诊断只是免疫性肝炎，就说明没有找到明确的病因。 免疫性肝炎是
一个很宽泛的概念。 |
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l*****y
发帖数: 5737 | 21 根据你的描述，不是太详细，腿疼指的是膝关节吗？胳膊是整条胳膊还是关节？
目前化验结果显示有一个高低度的抗核抗体，炎症的指标还在正常范围内，CRP稍高一
点点，而红斑狼疮特异性比较高的抗体抗dsDNA抗体是阴性的，还有几个相关的是不是
没检查？
建议去大医院全面的检查一下，比如北京协和医院的风湿科应该是全国最好的。个人觉
得红斑狼疮从现在的症状和检查上来看依据不足。
； |
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c****i
发帖数: 150 | 22 我在春秋季有膝关节痛，有时脚痛肿，有HAIR LOSS。起初以为痛风，可是化验却发现
ANA高，然后ANTI dsDNA阳性，RNP 弱阳性，Sm 弱阳性。医生没有进一步查说我SLE可
疑，让我吃Hydroxychloroquine 3个月再查血。
请问什么可以确诊LUPUS还是这几个指标就足够了？想找一个SECOND OPINION。 这个药
会永久伤害视觉，而且也为什么可以工作到现在也没有研究清楚。 谢谢 |
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l*****y
发帖数: 5737 | 23 anti dsDNA, anti Sm都是lupus相对特异性比较高的抗体了，C3低表示病情目前处于活
动状态。定期看专科定期复查吧 |
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t*c
发帖数: 6929 | 24 最好综合性大医院做免疫血液检查，
包括ANA，dsDNA等，这像孩子免疫系统
异常的表现，我已发短信给他们。如果确诊，
请务必早用激素控制。 |
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t*c
发帖数: 6929 | 25 最好综合性大医院做免疫血液检查，
包括ANA，dsDNA等，这像孩子免疫系统
异常的表现，我已发短信给他们。如果确诊，
请务必早用激素控制。 |
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t*c
发帖数: 6929 | 26 做个血检，检查ANA 和dsDNA抗体，先排除自我免疫系统的问题。 |
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f******g
发帖数: 1003 | 27 伊成器， 也是两篇nature
1. Yang CG*, Yi CQ*, Duguid E, Sullivan C, Jian X, Rice P and He C. Crystal
structures of DNA/RNA repair enzymes AlkB and ABH2 bound to dsDNA, NATURE,
2008, 452, 961. (*contribute equally).
2. Yi CQ, Yang CG and He C. A non-heme iron-mediated chemical demethylation
in DNA and RNA, ACCOUNTS OF CHEMICAL RESEARCH, 2009, 42, 519.
3. Yi CQ, Jia GF, Hou GH, Dai Q, Zhang W, Zheng GQ, Jian X, Yang CG, Cui Q
and He C. Iron-catalysed oxidation intermediates captured in a DNA repair
dioxyge... 阅读全帖 |
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s******s
发帖数: 13035 | 28 I can tell u what I have done in China
Synthesis 10 ssDNA of 60Nts each (indeed, should be 5 dsDNA with
anealing end), ligate 6 together to get Mixture1, ligate the other
4 to get Mixture2, ligate Mixture1, Mixture2 with vector and finally
got the right product. It means to ligate 10 ssDNA (5 ds fragment)
with vector in one step, and it works!!!! |
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f*y
发帖数: 876 | 30 T4 and lambda are both dsDNA tailed phages of E.coli. Both of them are being
studied as model phages,T4 as a virulent phage, and lambda as a temperate
phage. Despite of minor sequence similarity, many essential structural
proteins share the same folds, including the major capsid protein, portal
protein, tail tube protein and terminase. So the two phages must have
evolved from a common ancestor. However, because of the different life
styles (virulent/temperate), they have huge differences in the |
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w******e
发帖数: 1187 | 31 I suspected my dsDNA (100bp) pool (random sequence) dissociate and
form a messy mesh structure. When I run sample on a gel, many bands
show up above the expected molecular weight.
Anybody has exp with this problem? Thanks! |
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h****6
发帖数: 229 | 32 If it is high AT DNA, DNA may melt during gel running. If DNA melts, I
doubt it will re-form dsDNA under the same condition. ssDNA migrate slower. |
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a***e
发帖数: 1010 | 33 make fresh buffer and run the gel again.
make sure the loading buffer is correct.
generally, ssDNA runs faster than dsDNA with the same length. So should run
below, not above, your expected band. |
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w******e
发帖数: 1187 | 34 thx again. my situation is: I gel purified some 100bp pool a while ago.
the pool looked great on the gel for extraction (sharp 100bp band).
I didn't bother to run gel again after the extraction (stupid of me)
and just spec them and threw them in the freezer. I noticed a high
salt peak at 230 but felt I don't have to care for now.
today (~2 months later) I took it out, mix w/ normal loading buffer,
and ran it on a native TBE-PAGE gel as mass standard(I always use this
type of gel for short dsDNA |
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w******e
发帖数: 1187 | 35 thx for the input. PCR is a great idea. so did you see this kind of
dissociation happening in your exp? what are the factors that affect
the process? storage buffer? time? it's surprising to me as all the
newly prepared dsDNA pool have no such problem on gel.
is |
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M*****n
发帖数: 16729 | 36 two nicked dsDNA 转化效率好像比较低吧。
1 nicked 好像问题不大。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 37 谢谢。因为是seq的sample, 大小是一个smear, 几百bp到几kb，所以没法看大小。
同样，因为有的片断有几kp，我不是太放心这种大小的片断anneal效率怎么样，
有同学有经验么 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 38 把大片段再打碎一点，都控制在几百bp就不用担心anneal的效率了。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 39 I am still wondering why it runs around the similar position as its DNA
template. RNA product is ssRNA while the DNA templete is dsDNA…………
ds |
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s******s
发帖数: 13035 | 42 序列未知。
我试了一下random priming修成dsDNA，然后补平连接，不work. 可能是量太少，
或者是太小过柱太容易丢失。
现在考虑直接两头加Adaptor,然后pcr，这样会长一点多一点。有没有现成的protocol
可以用，或者大家有没有其他的好方法。
多谢了 |
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s******s
发帖数: 13035 | 43 有一个很变态的方法，如果你一直要做这样的检测可能有用，
否则你就deep seq吧
这个方法类似的去年好像有一个检查癌症单碱基突变的nature还是
science文章有，为你的改编一下大概是这样：首先PCR把你要的这段
P出来(cycle不要太多), 然后加热退火杂交，因为你的突变型很少，
所以大多数是完美双链，小部分是有一个mismatch的dsDNA. 这个东西
克隆到特定的载体里面，转化有识别mismatch的ecoli. 有mismatch的
就切开修了，顺便把载体里面下游的一个特定结构（比如loop)的致死
或者抗药基因也修掉了；否则不开修，这个转化子活不了。这样，你
spike几个不同比例的control，用转化colony多少做标准曲线就可以估计了 |
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s******s
发帖数: 13035 | 44 有一个很变态的方法，如果你一直要做这样的检测可能有用，
否则你就deep seq吧
这个方法类似的去年好像有一个检查癌症单碱基突变的nature还是
science文章有，为你的改编一下大概是这样：首先PCR把你要的这段
P出来(cycle不要太多), 然后加热退火杂交，因为你的突变型很少，
所以大多数是完美双链，小部分是有一个mismatch的dsDNA. 这个东西
克隆到特定的载体里面，转化有识别mismatch的ecoli. 有mismatch的
就切开修了，顺便把载体里面下游的一个特定结构（比如loop)的致死
或者抗药基因也修掉了；否则不开修，这个转化子活不了。这样，你
spike几个不同比例的control，用转化colony多少做标准曲线就可以估计了 |
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E********8
发帖数: 22 | 45 possible publication list for people graduated since 2010
118 伊成器
1. N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-
associated FTO.
Jia G, Fu Y, Zhao X, Dai Q, Zheng G, Yang Y, Yi C, Lindahl T, Pan T, Yang YG
, He C.
Nat Chem Biol. 2011 Oct 16;7(12):885-7. doi: 10.1038/nchembio.687.
2.Targeting MgrA-mediated virulence regulation in Staphylococcus aureus.
Sun F, Zhou L, Zhao BC, Deng X, Cho H, Yi C, Jian X, Song CX, Luan CH, Bae T
, Li Z, He C.
Chem Biol. 2011 Aug 26;18(8)... 阅读全帖 |
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f*******e
发帖数: 628 | 46 一般的 sample amplification 是把一个单分子原始 DNA 在一个 bead （或者其他介
质）上扩增成序列一样的的足够多数量的分子。 这个过程产生的 error 很小，比如 <
0.1%, 可以忽略不计。说这个过程可以纠正 error, 是因为在后续 sequencing 的时候
是读取的 amplification 之后整体产生的信号，所以即使这个集合里面某些少量的分
子产生错误的信号, 也淹没在 noise 里，不影响集合读出的正确序列.
相比较之下，single molecule 的方法只读取一个原始分子的信息，比如 nanopore,
读错了就错了，没有这么一个纠正的机制，所以就只能靠大量的 coverage 来弥补。
根据 nanopore 的网站，他们用某种 dsDNA binding enzyme 在 nanopore 的端口来
unzip double strand, 所以最后通过 pore 读取的是 single stranded
trinucleotide。一个分子被测序之后不会回来反复被测。所以要靠测序的 coverage
来弥补错误的话，就需... 阅读全帖 |
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s******s
发帖数: 13035 | 47 翻开gibson assembly protocol， 上书50ng 5kb dsDNA 0.015pmols
你这个乘以二除以50，大概6E-16x 6E23 = 360M？ |
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g*********5
发帖数: 2533 | 50 if long enough, try PCR. |
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