i*******n
发帖数: 48 | 1 姑且定义bait是membrane protein A， Prey是cytosol protein B
多种可能性
1.假阳性
2.细胞内蛋白B比较abundant,而膜蛋白A比较少。
如果是这种情况，跑western的时候减少input的量，增加IP的量，也许能看到。
3.prey蛋白B抗体识别的antigen region可能是bait A的binding region，导致你用
B的抗体IP下来的只能是不结合A的那部分。
如果是这种情况，给B加个tag或者换个抗体试一试。 |
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b******s
发帖数: 5365 | 2 很精彩的讨论啊，学习了！谢谢各位牛牛！
Sunnyday: 知道了cytosolic protein B和membrane protein A的binding region的情
况下，那么用tagged B binding region应该可以克服B和其他蛋白作用而导致IP A信号
弱的问题了吧？这个和你说的tagged A fragment IP B是一样的，可以算个反向IP.
关于FRET，这个能做出来当然非常好，而且可以证明是直接binding了，不过我对这个
assay一直是心存敬畏啊。如果已经有optimised 好的系统那还好，要是要从头
optimise的话，可能会很悲催。我知道有个phd student 花了4年时间来做FRET,文章是
发了，通篇就是FRET，但觉得很risky啊。 |
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T*****u
发帖数: 3257 | 3 希望表达在cytoplasm. 分crude membrane and cytosolic fraction发现在membrane
fraction里面。用cofocal看却看到在 everywhere。怎么回事？ |
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i***l
发帖数: 1656 | 4 分crude membrane and cytosolic fraction, how crude? sure 100% seperated by
centrifugation?
用cofocal看却看到在 everywhere, marker? plasma- membrane and introcellular
vesicle markers? |
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T*****u
发帖数: 3257 | 5 i used Na/K ATPase and GAPDH as marker for membrane and cytosol marker. |
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T*****u
发帖数: 3257 | 6 No. but the protein is supposed to be in cytosol. It's a very well
characterized protein
. |
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h******e
发帖数: 44 | 7 1. NTCP是coreceptor，需要其它receptor。HBV/HDV复制需要hepatocytic cytosolic
component，293估计不行。
2. 文章有人scoop。李文章出来几个小时，一个lab就寄来祝贺，并附上两篇in press
paper，方法不同，结论相同，也是找到NTCP。
我觉得close the deal可以慢慢来，establish the lead是首要任务。一个KI至少大半
年，拿一个六年的工作去赌，要是最后就差几天，不太值得。
subtype
been |
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j****x
发帖数: 1704 | 8 2里面说的Heidelberg的Stephan Urban组吗？ 纯好奇，呵呵
cytosolic
press |
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T****r
发帖数: 4006 | 9 就是因為有大lab要發，所以他們的送nature 13個小時後就悲劇了？
所以說，對於很多名氣沒起來的老闆，eLife是很好的機會，速度決定一切，還不會遭
遇莫名其妙的黑槍。 双贏～
cytosolic
press |
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p**t
发帖数: 160 | 10 另外两篇哪个杂志in press？
cytosolic
press |
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h******e
发帖数: 44 | 11 1. NTCP是coreceptor，需要其它receptor。HBV/HDV复制需要hepatocytic cytosolic
component，293估计不行。
2. 文章有人scoop。李文章出来几个小时，一个lab就寄来祝贺，并附上两篇in press
paper，方法不同，结论相同，也是找到NTCP。
我觉得close the deal可以慢慢来，establish the lead是首要任务。一个KI至少大半
年，拿一个六年的工作去赌，要是最后就差几天，不太值得。
subtype
been |
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j****x
发帖数: 1704 | 12 2里面说的Heidelberg的Stephan Urban组吗？ 纯好奇，呵呵
cytosolic
press |
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T****r
发帖数: 4006 | 13 就是因為有大lab要發，所以他們的送nature 13個小時後就悲劇了？
所以說，對於很多名氣沒起來的老闆，eLife是很好的機會，速度決定一切，還不會遭
遇莫名其妙的黑槍。 双贏～
cytosolic
press |
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p**t
发帖数: 160 | 14 另外两篇哪个杂志in press？
cytosolic
press |
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D***a
发帖数: 516 | 15 不小心搜到这一贴。只想问问，都过去4个月了，怎么还看不到这两篇in press的文章
发表？
cytosolic
press |
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a**m
发帖数: 184 | 16 前两天看到一个thesis proposal大概讲的是如何研究一个酶在cytosol里面的toxic
gain of function和nucleosome里面的loss of function云云，感慨如果人生美好的四
年五年一直在bench上面和这个分子层面的酶打交道确实不值得，不如转行。倒是反过
来如果没有这一点点的积累认识，科学不会发展。。。
现在在做methodology和analysis，不用做benchwork，但是在办公室待得时间更久了，
经常直到凌晨以后回家。12点统计系还是大把大把的有人。盯着屏幕整一天下来头昏眼
花，躺在床上脑袋停不下来也就很难入睡。所以，如果只是phd想找个轻松的活而转行
，那就没必要了，phd轻松不轻松，看个人看老板不是看专业。
另外，转行的人，真心没有必要恶语相加。留的人，更没必要妄自菲薄。
多。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 17 不奇怪
人家team PD 出来的 tenured Asso. Prof. 的华裔 就一堆 哦 Lol
>http://lindquistlab.wi.mit.edu/Alumni.html
Jiyan Ma (postdoc 1997-2002) studied the cellular mechanisms of prion
diseases.
He is an Assistant Professor at The Ohio State University.
now MJY already Asso. Professor there:
>http://biomed.osu.edu/mcbiochem/11379.cfm
cns PD 期间的 一作 的 记录 可能也是必须的
Ma, Jiyan; Wollmann, Robert; Lindquist, Susan. (2002)
Neurotoxicity and neurodegeneration when PrP accumulates in the cytosol.
Science. Vol. 298, no. 559... 阅读全帖 |
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r***e
发帖数: 2539 | 18 顶这个，没错。
其实都不要digitonin，直接上低渗buffer，我用0.1M TrisHCl, no salt。冰上放10分
钟。10万g离心，上清就是cytosol，pellet用含1% Triton 的buffer弄出membrane pro
tein。 |
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C********4
发帖数: 308 | 19 1）DT注射到体内的量很少，一个细胞分不到多少DT; 2) DT有两个亚基A和B，B负责跟
受体结合进细胞，并在endosome/lysosome里降解，A进cytosol里搞破坏。即使A流出来
，没有B也进不了别的细胞。3）现在打靶载体上都带DTA做阴性筛选，从来没有见到DTA
从被杀死细胞流出来影响别的细胞。
再有就是这个方法已经应用了超过10年，没有遇到过问题。做这个改进主要是两个目的
： 1）提高细胞剔除效率: A)用强启动子，使DTR表达水平提高；2）加EGFP使细胞可以
被追踪又可以随时被清除，比如我们想观察某群细胞被杀死之后的再生情况。 |
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S******e
发帖数: 393 | 20 将S1 (cytosolic protein) 和 S3 (nuclear soluble protein?) 去掉后，剩下的
pellet再用0.1%的Triton extract, 收集到的上清暂称为X，想知道X是些什么蛋白？
Chromatin associated protein?
方法如下：
1. Cells were extracted with Buffer A (10mM Hepes pH7.9, 10mM KCl, 1.5mM
MgCl2, 0.34mM Sucrose, 10% Glycerol, 1mM DTT plus protease inhibitors)
containing 0.1% Triton for 5 min on ice, centrifuge 1300g X5 min, discard
supernatant (S1), wash once with BufferA and discard supernatant.
2. Extract cell pellet with Buffer B (3mM EDTA, 0.2mM EGTA, 1mM... 阅读全帖 |
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w***7
发帖数: 1637 | 21 宋的文章够了，experience不够让人信服。
宋的博士学位在中科院拿的，在us做了3-4 年postdoc。宋在us 待的时间太短，对美国
博士培养体制和科研体制先进之处了解得可能不够。一同面试院长的有几个candidate
文章比宋好。武大可能是看到宋在中科院当个官，搞个管理就把it请过来了。武大应该
找一个在美国拿个PhD，然后在us 做postdoc后海归的当院长。
宋自己的科研做得很好，但对宋领导一个院做出像样的改革，大幅提高整个院科研水平
不太看好。
http://www.bio.whu.edu.cn/News_reads.asp?cid=174&id=2574
学习经历：
1993－1997 南京大学生物科学与技术系，学士
1997－2002 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，博士
主要工作经历与任职情况：
2002－2005 美国德克萨斯大学西南医学中心，博士后
2005－2014 中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，研究组长，研
究员，博士生导师，“百人计划”择优支持，“百人计划”终期评估优秀。分子生物学
国家重点实验室... 阅读全帖 |
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w***7
发帖数: 1637 | 22 宋的文章够了，experience不够让人信服。
宋的博士学位在中科院拿的，在us做了3-4 年postdoc。宋在us 待的时间太短，对美国
博士培养体制和科研体制先进之处了解得可能不够。一同面试院长的有几个candidate
文章比宋好。武大可能是看到宋在中科院当个官，搞个管理就把it请过来了。武大应该
找一个在美国拿个PhD，然后在us 做postdoc后海归的当院长。
宋自己的科研做得很好，但对宋领导一个院做出像样的改革，大幅提高整个院科研水平
不太看好。
http://www.bio.whu.edu.cn/News_reads.asp?cid=174&id=2574
学习经历：
1993－1997 南京大学生物科学与技术系，学士
1997－2002 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，博士
主要工作经历与任职情况：
2002－2005 美国德克萨斯大学西南医学中心，博士后
2005－2014 中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，研究组长，研
究员，博士生导师，“百人计划”择优支持，“百人计划”终期评估优秀。分子生物学
国家重点实验室... 阅读全帖 |
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o*******a
发帖数: 242 | 23 thx, 他实验室是一窝老中啊！文章发的真是牛逼。
这个cGAS是他实验室首次发现的吗？
Discovery of cGAS-cGAMP pathway and its role in immune defense
We identified cGAS, which directly binds to cytosolic DNA and synthsizes
cGAMP from GTP and ATP. cGAMP with mixed phosphodiester linkages binds to
STING with high-affinity and induces STING conformational change and
interferon expression. We generated cGAS knockout mice and cell lines. Using
these reagents we found that cGAS-cGAMP pathway is important for immune
response against DNA viruse... 阅读全帖 |
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s*******7
发帖数: 399 | 24 =============
cGAMP有几个人争来争去，尽管如此，阿戈个人认为chen在cGAMP的发现过程中是领衔主
演。
另，至于cGAS，这个就是他首先发现的。参考他在science的research article文章：
Cyclic GMP-AMP Synthase Is a Cytosolic DNA Sensor That Activates the Type I
Interferon Pathway |
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r***e
发帖数: 2539 | 25 请教做过这个实验的高手。
HDJ2和Rap1a分别作为抑制farnesylation和geranylgeranylation的marker，阳性对照
是FTI-276和GGTI-298,我知道抑制修饰本身没问题。（因为用fractionation assay做
过，而且cytosolic fraction做过Kras的质谱，确认没有修饰了，所以样品没问题。）
reviewer一定要bandshift的实验，我尝试过不同浓度的precast bis-tris gel，MOPS
和MES buffer都试过了，还试过把目的蛋白跑到最下面，都跑不出很明显的区别。文献
一般都是用普通的tris-glycine gel （8% for HDJ2, 12% for Rap1a），这个有关系
吗？
请高手指点，谢谢！ |
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r******k
发帖数: 446 | 26 If i used whole cell lysis ( with our cell fractionation), i saw very
abundance of protein bands with the stain of ponceau S. However, after i
fractionated the sample, it seems nothing can be detected, even in the
cytosol. I have no idea why. 难道cyto/nucleus被抽出来的过程会使得蛋白降解？ |
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A******y
发帖数: 2041 | 27 Quick question, does triton 100 alone consider hypotonic lysis and you will
only get cytosolic portion? |
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f********1
发帖数: 367 | 28 我的triton是在PBS里的，我改过来了。不好意思。
如果只有triton的话，除了cytosolic portion,细胞膜上的蛋白也会溶的吧？是不是还
有细胞外的蛋白？
我也不是很确定。
will |
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r******k
发帖数: 446 | 29 我试了试用293t细胞做cell fractionation，但是总是有cytosol的marker在nucleus的
extract里面。是不是这种细胞不好做呢？我用别的细胞做没那么严重。。。 |
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r******k
发帖数: 446 | 30 我觉得它的意思是把cytosol的遗留物品都洗干净。但是我已经这么做了。。。还是有
很多tublin在nucleus里面。。。。 |
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n******d
发帖数: 1055 | 32 "cGAS主要在细胞核里"? 你口误了吧，cGAS is a cytosolic DNA sensor.
cGAS 必将变成经典，查一下引用就知道了。 |
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T****a
发帖数: 409 | 33 在网上搜了一圈，没看到什么protocol。请问有没有谁做过可以介绍一下？
多谢！ |
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m***y
发帖数: 627 | 34 我也有此需求，一直没有找到特别好的办法
yuban 提的方法也试过，感觉不能得到特别好的结果。 |
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y***n
发帖数: 109 | 35 为什么不好？
用的是confocal还是epi？ |
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p****t
发帖数: 18 | 38 另一个功能未知的蛋白可能没有表达成功，可以在C端连一个GFP看看亮不亮，或者转完
细胞之后做个 western 看看大小对不对。
固定之后用抗体看 endogenous 的这两个蛋白呢？这样子看到的共定位会比过表达更可
信。也许只是过表达之后 saturate binding site，所以看到的大部分 cytosolic。
还有一个可能性就是细胞在调控这个蛋白的相互作用，修饰之后就把interaction关掉
了，需要在特定情况才会去修饰。而纯化出来的蛋白没有修饰。 |
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发帖数: 1 | 39 Before I start, I’d like to make my point crystal-clear. This will be
serving as my
last post on this subject and I am not interested in any college-level
discussion.
How soon do you want to close your statistical data collection? I guess
this time window of reproducibility will be determined by the journal and
the whole scientific community. Dr. Han’s fate does not concern me from
the beginning. However, I do care the quality of arguments against Dr. Han’
s
paper written up by some green-hand... 阅读全帖 |
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