b*********b
发帖数: 64 | 1 如果你很想了解confocal或者更高级的two-photon，下面两篇paper对你会有帮助。
1.Ojcius DM et al.Immunology and the confocal microscope. Res Immunol 1996
2.Cahalan MD et al.Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a
fresh light.Nat Rev Immunol 2002
ZL1999 (胖头猫)提到了confocal和一般fluoresent microscopy的区别，除了有一点我
不太认同，根据我的理解，confocal microscopy的photobleaching问题应该比一般的
fluoresent microscopy要小，因为前者illuminate smaller volume of your sample。
如果你要做的是培养的细胞，你可以不用改protocal，我一般用8-well chamber slide
，这样一张slide上可以有8个samples。coversl... 阅读全帖 |
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Z****9
发帖数: 738 | 2 confocal用的是PMT detector （大部分），这个的对光的检测效率（quantum
efficiency）在30-40%左右，对red 或者far red的检测效率更低
普通的fluorescent microscopy 用的是CCD 或者EMCCCD，效率在60-70%
confocal由于pinhole的存在，不但屏蔽了out focus的光子，同时也屏蔽了很多有效的
光子。
这两个原因，造成了confocal比普通的fluoresent microscopy的bleaching严重
a
sample。
slide |
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q*****n
发帖数: 331 | 3 It should work.
Make sure your confocal system have all three lasers to excite the
fluorophore. Some confocal system does not have the blue laser. |
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b*********2
发帖数: 35 | 4 我记得以前看过confocal的最佳分辨率是 ～0.5 nm。对吗？
这个范围适用于荧光基团的分辨吗？
如果只有一个Cy3标记的RNA，可能用Confocal观察到吗？ |
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Z****9
发帖数: 738 | 5 分辨率指的是能分辨两个物体的最小的距离
如果你有两个荧光团，彼此之间的距离小于比如 0.2 nm，通过普通的confocal是无法
分别出来时一个荧光图还是两个
confocal 能否监察到到一个cy3 标记的RNA，取决于你的系统的灵敏度，和分辨率没有
任何关系 |
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v***a
发帖数: 1242 | 6 以前只做过一般的dual-labeled 荧光显微镜，包括tissue和培养的细胞染色。请教如
果现用confocal，有什么不一样的地方需要注意吗，可以不改动protocol直接去看否？
比如细胞染色，我一般是用no.1的coverslip养在上面，现在看到paper里有人做
confocal用的是membrane inserts养细胞，还有的人是用的no.1.5的converslip。这些
都该如何选择比较好？fixative的选择有什么注意吗，我一般都不用Paraformaldehyde
，但paper里几乎清一色都是，而且是用ice-cold PFA fix几个小时。可以用RT PFA来
fix比较短的时间吗？
谢谢！ |
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c*********r
发帖数: 1312 | 7 我们用Leica SP5，普通的confocal，激光最多穿透个100多micron。用two photon
confocal会更好些，但也只是几百micron吧。 |
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w*e
发帖数: 740 | 8 我们 用的INVITROGEN的PROLONG GOLD MOUNTING MEDIUM
防止淬灭，特别是做CONFOCAL Z STAC扫描的时候 |
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p*l
发帖数: 1359 | 9 The best confocal can give you 0.3 um resolution but .5 is more practical.
To see RNA with single label, you need several things. First, no strong fluorescence
background. Then photon counting detectors or EMCCD. Last if you want
see RNA one by one, make sure there is only one RNA per .5 um radius. |
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b******s
发帖数: 1089 | 10 2D bleach size 可以直观看见，但是怎么知道z轴方向被bleach多少厚度?
confocal is Leica SP2
谢谢. |
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b******s
发帖数: 1089 | 11 多谢sunny。
confocal有俩pinholes。bleach在axis上的厚度应该只与入射光的pinhole有关。而且
一般软件里给的估计值是基于point spread function，入射光波长488nm的时候，axis
上估算值大概是500nm。但是在一个给定的ROI内，scanned的points很多，这样最后在
axis上被漂白的区域远远不止500nm。不知道这样理解对不对？
微镜 |
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b******s
发帖数: 1089 | 12 扫描confocal有两个pinhole
入射光的pinhole可以使得入射光成为一个point light source，这样即使penetrate进
入tissue，根据airy disc图，focal plane之外的illumination越远越可以忽略不计。
optical section跟俩个pinhole都有关系，但是我觉得bleaching effect和
detector前的pinhole没有关系。 |
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s*****j
发帖数: 6435 | 13 confocal 不就是那来扫三维的吗? bleach完以后, 扫一个, 你就知道在z方向bleach
了多少了. |
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s*****j
发帖数: 6435 | 14 不存在什么模型的问题. point scan confocal的光路是个cone structure. 焦点处光
强最大, 嚗光时间短. 其他地方光强小, 嚗光时间长. 那些地方会bleach点是算不出来
的.
bleach的原理是什么现在也是糊里糊涂的. invitrogen的所谓anti-bleach agent有没
有用全靠运气了.
leica SP2 如果你有piezo z-stage, 就扫一个xyz/xzy很快的. |
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f******9
发帖数: 22 | 15 Has anyone done three color for three different protein colocalization?
which second antibody did you choose?
I am quite confused with the multi choices from company. There are so many
fluorescent dyes. I mainly use Alexer from invitrogen. Has anyone work with
confocal before, any experience can share?
Thanks in advance. |
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D*a
发帖数: 6830 | 16 你们confocal没有专人管吗，最简单的是去跟那人聊聊，拍几张看看。 |
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v***a
发帖数: 1242 | 17 蛋白在普通荧光上的条件已经做出来了，就是不知道confocal有没有什么特别 |
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n********k
发帖数: 2818 | 18 what's the difference between regular IF and confocal then?... |
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l**********1
发帖数: 5204 | 19 Please refer:
scanned Bessel beams in conjunction
with structured illumination and/or two-photon excitation to create thinner
light sheets (<0.5 μm) better suited to three-dimensional (3D) subcellular
imaging
PubMed link:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21378978
Planchon TA, Gao L, et al.
Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam
plane illumination.
Nat Methods. 2011 May;8(5):417-
>Abstract
>A key challenge when imaging living cells is how to noninvasively extract... 阅读全帖 |
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m*******y
发帖数: 16 | 20 coverslip的厚度是镜头决定的，有的镜头可以调来适应玻璃厚度，你直接问管显微镜
的人
一般说confocal bleach比较快是因为激光汇聚在在焦点上，虽然每次只激发很小的体
积，但是这个体积内的能量密度很大。同样，管显微镜的人肯定会培训你再让你上机的
，他肯定会教你尽量从小的激光功率开始
a
sample。
slide |
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b*********b
发帖数: 64 | 21 深度了解了一下，ZL1999 (胖头猫) 和 mammothcy (mammoth) 说的都非常有道理，
Confocal的photobleaching确实比一般fluorescent严重。 |
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s*****j
发帖数: 6435 | 22 "confocal由于pinhole的存在，不但屏蔽了out focus的光子，同时也屏蔽了很多有效的
光子。"
pinhole setting 在 1 airy disk size的话, 95%以上的你所谓"有效光子"都会通过
pinhole( scattered 除外). 不存在"屏蔽很多"的问题 |
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m*****j
发帖数: 144 | 23 confocal stack 成像，打算弄成有3维长度坐标的图像，请问大家都用什么软件操作啊
。我们系用的是Zeiss 5,可是倒霉的是，没有了3D和topography的功能，结果没法用
这个软件做3D了，只能做成2.5D,Z-axis实际上是intensity而不是长度坐标。
看网上有人用imageJ, BioimageXD,自己下载下来了，用了也不是特别好用（也可能是
自身原因，说明书没看完）
请大家推荐个好用的软件吧 |
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b******s
发帖数: 5365 | 24 用惯了inverted confocal microscope再去用upright,真悲催。不但不能做live cell
imaging, 那个盖coverslip真是麻烦， 还很容易搞得很messy;能用的chamber slide
也是寥寥.....@#$%! |
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d*********s
发帖数: 390 | 25 Someone used follow Ab,Please let me know which Ab is better for confocal
microscope!
1. c-Myc Antibody (9E10): sc-40
2. c-Myc Antibody (9E10) FITC sc-40 FITC
Many thanks!
God bless you! |
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b*******0
发帖数: 48 | 26 最近要研究老鼠致死机理，打算做个in vivo axon transport. 之前用sensory neuron
做过lysosome transport.
现在想要在explant 里做 in vivo.这个对显微镜要求高么，实验室没有confocal,好做么
谢谢 |
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y***n
发帖数: 109 | 27 光是confocal都不一定可以，可能得上双光子吧。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 28 比如切50微米，或者更厚一点的切片，然后放到片子上做confocal，求能保存组织厚度
做Z轴的产品，或者大家都是怎么封的，求推荐。50微米只是暂定的，如果能再厚一点
更好。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 30 话说我上次封了几个E11和E10,感觉激光完全透不过去啊，而且如果前几层有大量绿荧
光的话，后面几层荧光虽然变成背景了但是还是有绿噪点，我根本没找着我想看的器官
。不知道是不是我们confocal的问题？
那几个片子我后来又扒开把器官解剖出来了，简直是天上地下啊，后来的胚胎我只能先
解剖再做whole mount，不敢直接封了。
问题是这样的话我跟前人的数据比较起来就有问题，难道为了比较只能跟他那样把整个
胚胎切了...想偷懒也没偷成..... |
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p*l
发帖数: 1359 | 31 Wide field image you see will always be better than what you get from
confocal. There are multiple reasons.
First, in wide field you see fluorescence from multiple layers, so the
signal is stronger.
Second, believe it or not, human eye is more sensitive than most PMT and
cameras. Human eye can detect single photon with minimal dark noise if your eyes have stay in dark for a long time. The drawback of human eye is it can only refresh the image 10~20 times per second, and you can't save the image ... 阅读全帖 |
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x****y
发帖数: 1853 | 32 结构生物学和分子生物学最后都是为了解答蛋白质怎么跟细胞相互作用的问题。 只是
看问题的尺度不一样而已。 所有结构生物学的分析手段都基本上看死的结构，不是生
物体正常的环境。比如X-ray要求结晶，电镜要求冷冻， NMR要求泡在某种液体加强磁
场和同位素替换。这些实验要求都已经改变了蛋白质native的活性的状态。
退一万步，哪怕你得到活性的原子级别结构， 又怎么样？ 你只能看着这个原子结构图
， 猜想这些原子那些键怎么去跟细胞相互作用。
Confocal是直接在细胞的尺度看相互作用。跟结构生物学相比，首先它看得是活的细胞
。 通过荧光label，你可以清楚看到哪些protein在哪个function. 这比原子结构重要。
在Confocal出来之前，很多医院都用TEM来做histology 和 pathology. Confocal出来
以后，很多TEM没人用了。因为尽管你有分辨率，但是你出来的信息不如confocal那样
直接解答生物学的问题。很多医院里的electron microscopists 还因此失业。我本人
做电子显微镜设计，看着不少电镜从医院里被de-commissio... 阅读全帖 |
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M*****n
发帖数: 16729 | 33 an old crap.
no one knows how to use it, so boss hired somebody from a company to give a
2-day workshop.
Our confocal training by Leica also costs a few thousand dollars for every 2
-day session.
I am able to train the confocal users, but my boss doesn't want to waste my
time on that. so he just asked the users to share the cost everytime.本来俺
可以赚点外快的。
不过俺用confocal赚了点外快。上次俺们这儿医院拍广告，俺把俺的confocal images
给他们用了，他们给了俺250块劳务费。nnd,居然还要给这250缴税，到手只有160了。 |
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p*l
发帖数: 1359 | 34 三年前买了个Olympus的显微镜，只是Epi。Olympus算比较实惠的牌子了。Nikon当时的quote差不多。别的牌子我不想买。这是我记得的价钱：
Olympus IX71 microscope frame $15k
Epi lamp $4000~8000 depending what kind of lamp you want。
Objective lens 每个$2000~$10k 不等，各个倍数最好的配齐大概$15～20k
每套filter 加cube ～$3000
Motorized x-y scanner >10k
Z-scanner, 这个只有做confocal才用的上，不知道具体价，估计$20k。
我的假设是你不会自己买confocal。如果买confocal，你要多少线激光，多少道PMT，速度多快，价钱上差的就远了。
Camera: cooled ccd camera >10k, EMCCD >50k。我当时没买，今年买排队抢了个新上市的sCMOS，强烈推荐，速度快，灵敏度不比EMCCD差，$22k。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 35 哦。。。那个肯定会吓倒他们。
除非是学术明星，或者你除了这个confocal 之外其它东西都不买了，否则这个
愿望很难实现。
而且大部分系里都是shared 的，这个你可以把预期的使用费用作为你的start-up
cost 列进去。比方说每小时20美元，一般实验室每年至多用500小时，也就是
1万美元而已。
除非你有一些特别的用途（比方说需要过夜长时间live time imaging),
或者你本身就是研究光学成像技术的，需要亲手在显微镜上做改动，
否则很难justify 30万的新confocal microscope
另外，要么，你找我师姐pll给你山寨一个显微镜算了。
confocal |
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s******y
发帖数: 28562 | 36 我相信她有这个能力：）
不过她最近在度假呢，下个星期应该就回来了。到时候你自己问她吧。
另外，既然你其实并不是那么想去这个学校的话，那就多要一点，一方面是可以
用来和其他你想去的学校讨价还价，另外一方面，万一最后没有拿到更好的学校
的offer, 拿到了那么多钱，去了这个学校心里也高兴一点。
至于说要价什么的，其实主要是看你的需要。我们系里面前一个法考题，来的时候
给了非常非常非常多的钱，主要是因为她当时来的时候，整个学校没有做她那个
方向的，所以不得不给她钱来建立了一个core facility.
所以如果你真的想要那个confocal microscope 的话，你可以强调是和系里现有
的是不同的功能的（比方说系里的是普通的scanning confocal, 而你要订的是
做活细胞成像用的 spinning disk confocal），或者说你将来的实验室会用
非常频繁的用那个显微镜，比方说每天要超过4个小时，或者经常会经常用过夜
等等，所以不适合和其他实验室share. |
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J********i
发帖数: 50662 | 37 多谢。。。
我就要个普通的，不用confocal，我要看的东西很大，几十个微米
我去査一下tokai
买个一般的wide field的可能要几万块
confocal的应该是20-80万不等，看配置
TIRF基本可能和confocal差不多
控温得好象要另外买，我们用的叫TOKAI |
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L****S
发帖数: 76 | 38 那位大虾用过 image J 分析 nikon 的confocal 图像？ 我以前用的是一款德国的
CONFOCAL 显微镜，图像是.lsm 格式。但是最近适用 nikon 的confocal C1， 图像是.
ids 格式， 但是 image J 却无法打开这个格式。 求大虾帮助。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 39 楼主是个半路出家搞Laser scanning confocal microscope (LSCM) 的?
好好看下红宝书/圣经吧
//onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/0471142727.mb1410s44/abstract
free download link is here:
//webdoc.nyumc.org/nyumc/files/sun-lab/attachments/CPMB.Ch.14.Situ.IHC.pdf
its pp146
UNIT 14.11
Basic Confocal Microscopy
by Carolyn L. Smith
1National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Bethesda, Maryland
and
//www.olympusconfocal.com/theory/signaltonoise.html
//micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/confocal/index.html |
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l**********1
发帖数: 5204 | 40 那本CLSM圣经 free download ok now
its pp157
Illumination intensity
Fluorescence emission increases linearly
with illumination intensity up to a level at
which emission saturates. Optimal signal-tobackground
and signal-to-noise ratios are obtained
with illumination levels well below saturation
(Tsien et al., 2006). The illumination
intensity on a laser-scanning microscope can
be adjusted by operating the laser at submaximal
power and by inserting neutral-density
filters into the light path or varying... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 41 For LIVE IMAGING
please transfer to LSM 5 Live; Carl Zeiss instrument if your college/university has it.
那本圣经 free download ok now
cited from its pp152
>
A new type of slit-scanning confocal microscope
(LSM 5 Live; Carl Zeiss, Inc.) has
recently been introduced that allows images to
be acquired at rates as fast as or faster than
can be achieved with a spinning-disk confocal
microscope, and with as low or lower rates
of photobleaching. The system adopts principles
from both the spot scanner and ... 阅读全帖 |
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s*****j
发帖数: 6435 | 42 其实应该问的问题是为什么 point scan confocal一定要用PMT, 而不是一个 single
pixel的CCD chip. 尽管现在CCD的QE接近1, 而PMT的QE在50%以下. confocal也有用CCD
和水银灯的, 就是你说的什么"发散光源" .
widefiled是指整个 field of view 在同时被激发, 如果你只看某一个特定的点, 光
路和 confocal没有什么区别. 什么叫"光斑变大"? 你和另外一位一样(copy一个有效分
辨率的表来说视野.), 根本就没搞清楚 field of view, kohler illumination,
resolution limit, point spread function 之间的区别. |
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s******y
发帖数: 28562 | 43 老兄你有所不知啊，这几年国内的学校院所到处乱买仪器，所以单就仪器而言的确超过
了美国的大部分学校。比方说有些地方，每个实验室里都放着一台最高档的confocal
microscopy，而我以前那个学校，好几个系一堆人排队用那么几台旧机器。我现在这个
学校更扣，医学院只有scanning confocal, 没有spinning-disk confocal，要用的话
就要到另外一个学校去。
当然唯一的缺点就是国内很多地方买来了仪器也就是搁置起来，很多功能都用不到。 |
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s*****j
发帖数: 6435 | 44 最近看韩的事情很热闹, 不少人的态度说网上讨论科学问题不好.
想起以前的一件事, 是十多年前了, 在 Confocal email list 上. 有个ID发了个图,
是某个组做PH-sensitive dye. 用这种dye 的 强度来测样品里的PH value. 图里面几
个 control 的样品, 被认为是PH 值恒定来做校准的. 看起来是很不恒定.
ID 就问: 这样的测量有多大可信度? 有人附和.
文章作者也出来了, 回复了一下. 下面争论就更多了. 文章作者也不再出来了.
这个时候来了一个ID, 自称老ID, 说你们这样不对, 也不好. 网上瞎指责谁不会呀?
科学讨论不应该这样, 觉得有问题直接发信的原作者, 或者杂志.
结果炸出来了一个元老级ID, James Pawley. 做 Confocal 的人多少也知道这位, 那
本号称”BIBLE” 的 “handbook of biological confocal microscopy” 就是这位主
编的.
元老级ID上来就直接说 “网上讨论科学问题不好?” 没那事. 科学就是拿来讨论的,
网... 阅读全帖 |
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P**********e
发帖数: 2964 | 45 http://www.sciencemag.org/content/335/6076/1562.summary?ref=top
Since 2000, Brad Amos, inventor of the laser scanning confocal microscope,
has been working on the "Mesolens," a lens capable of capturing a similar
level of detail as a confocal alone, but on a far larger scale. Where
existing microscopes have lenses up to 3 centimeters long, the Mesolens is a
massive half a meter, which means it can capture a specimen as big as a
mouse embryo in a single shot. And whereas a confocal microscope can... 阅读全帖 |
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f****l
发帖数: 8042 | 46 confocal, 乞丐版，100k刀起，顶配300k刀起；不同confocal可以有10种以上。
离心机，落地式，100k刀起，一个离心转头3k起；
一套小电泳设备3k－5k，实验室起码3-5套吧；
神马各种光谱扫描和读取设备，基本上一台一个保时捷。
实验室最便宜的就是电脑了。 |
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发帖数: 1 | 47 以前我也觉得没啥
2015年nature屎正丽的文章就是一个打酱油的中间作者
但是当前两天屎正丽作为通讯作者再发nature的时候，我去读了一下两篇文章，这个屎
正丽真像一坨屎。
你仔细看2015年的这篇文章，author contribution，你会发现，屎正丽的工作正是，
改造病毒，重新构造载体，这个工作技术难度其实很小，一个普通研究生就能做。但是
当时她去北卡做的，不知道是不是访学。一串作者当中就两个华人。如果这个武博士说
的属实，美国停了这项研究的话（可以自己去查证，我不是方舟子也没空咬谁），那就
更好解释了，她自己改造病毒，构建载体，顺手偷plasmid这个是访学的强项，而且这
项没有经费的材料，她都不用偷偷摸摸的偷，她估计更那边实验室说一下要顺走，拿回
中国，那边也无所谓，当然我更倾向于她没有说是偷的。
理由很简单，在2020 的nature当中，所有作者都是中国人，连群众作者都没挂洋人，
也没有北卡那边单位，所以也证实是悄悄偷的，不记得在致谢里面有没有，如果致谢都
没有，屎正丽100%是把当时2015年的质粒载体图谱序列所有的都是偷回去了。
前两天的nature更恶心，... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 48 以前我也觉得没啥
2015年nature屎正丽的文章就是一个打酱油的中间作者
但是当前两天屎正丽作为通讯作者再发nature的时候，我去读了一下两篇文章，这个屎
正丽真像一坨屎。
你仔细看2015年的这篇文章，author contribution，你会发现，屎正丽的工作正是，
改造病毒，重新构造载体，这个工作技术难度其实很小，一个普通研究生就能做。但是
当时她去北卡做的，不知道是不是访学。一串作者当中就两个华人。如果这个武博士说
的属实，美国停了这项研究的话（可以自己去查证，我不是方舟子也没空咬谁），那就
更好解释了，她自己改造病毒，构建载体，顺手偷plasmid这个是访学的强项，而且这
项没有经费的材料，她都不用偷偷摸摸的偷，她估计更那边实验室说一下要顺走，拿回
中国，那边也无所谓，当然我更倾向于她没有说是偷的。
理由很简单，在2020 的nature当中，所有作者都是中国人，连群众作者都没挂洋人，
也没有北卡那边单位，所以也证实是悄悄偷的，不记得在致谢里面有没有，如果致谢都
没有，屎正丽100%是把当时2015年的质粒载体图谱序列所有的都是偷回去了。
前两天的nature更恶心，... 阅读全帖 |
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M*****n
发帖数: 16729 | 49 confocal 的service contract很贵的。
买二手就是凭一个运气了。
不过现在简单的confocal也不是很贵了，十几万就能搞一台，spin disk估计三十万之
内高定了。
fully loaded的epi也要十万哦。 |
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p*l
发帖数: 1359 | 50 你们都来找我吧！我买了个空显微镜架子，自己造了个confocal。后来想加一个四色
epi上去，一quote，一个灯加上四套filter要万把，我就自己拿LED山寨了个光源，
ebay了个filter holder，自己配的filter，大概两三千搞定了。
有时候想，如果tenure拿不到要走人，我就造confocal卖去。 |
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