T**********t
发帖数: 1604 | 1 我就是用的BL21(DE3)pLysS strain，用0.4mM的IPTG诱导，表达4hr，蛋白产量很好。
T7 lysozyme是T7 RNA polymerase的natural inhibitor，它的表达是为了抑制在BL21(
DE3)里比较常见的leaky expression，但是这个表达量不至于抑制被IPTG诱导后的
expression。而且lysozyme不是蛋白酶，不可能降解你的蛋白。
你的蛋白如果用BL21(DE3)表达很好，说明你的蛋白对E.coli没有细胞毒性，你可以不
需要用BL21(DE3)pLysS来表达。
还有就是你看一下你用的是BL21系列还是BL21 Gold系列，这两个系列都有(DE3)和(DE3
)pLysS，但是我用BL21 Gold系列就碰到过表达不出来的问题。我说的BL21和BL21 Gold
都是Stratagene（现在的Agilent Genomics）的产品，不知道别的公司是不是也是这么
标识的。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 2 对，还有一个我忘了说，就是检查一下培养箱温度。
我原先用BL21-Gold的DE3 pLysS表达出现问题troubleshooting的时候，后来发现就是
培养箱温度不对，设定37度，实际到了39度。这时候用BL21的DE3 pLysS表达就没有问
题，但是BL21-Gold的菌液几乎完全被lyse掉了。所以后来虽然我把培养箱温度重新设
定好了，还是不敢再用BL21-Gold的菌株了。
induction. |
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g*****y
发帖数: 6325 | 3 我的蛋白bl21(DE3)的细胞里0.5mM IPTG induction 表达很好。后来转到BL21(DE3
pLysS)里 加IPTG却不表达我试过
0.1-2mM的IPTG. 2hr, 4hr 和 o/n. 2mM IPTG O/N 好像有一点点表达。。 都是同样
的蛋白同样的hosting vector. 现
在怀疑是不是BL21(DE3 pLysS)里表达的lysozyme 把我的蛋白降解了? 不太可能啊！
大家有没有遇到类似的情况呢？ |
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s********n
发帖数: 2939 | 4 既然在BL21(DE3)表达很好的话，为什么还要试BL21(DE3)pLysS呢？有特殊原因？我的
经验是BL21(DE3)pLysS表达很多蛋白都不好。 |
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g*****y
发帖数: 6325 | 5 是的lysozyme 降解多糖的。。 不应该降解我的蛋白。 我表达好的是bl21 gold. 但是
我最后是必须用plysS这个菌株的因
为这个菌株是从别的实验室拿来的还有另一个特别的属性是我需要的。 我现在想在没
有chlor resist 的LB培养这个菌株一
段时间直到它失去plysS这个vector. 不知道可行吗?
BL21(
DE3
Gold |
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h*******0
发帖数: 48 | 6 我觉得很多时候不表达是因为菌种污染了
不是BL21或者菌里没有质粒
只要是含表达载体的BL21，肯定可以通过诱导表达的 |
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H*g
发帖数: 2333 | 7 Sorry only could type in English using lab computers
I a trying to express protein in E.coli and am wondering if I should save
glycerol stocks for transformed
BL21(DE3) or Rosetta2(DE3) strains for future or should we always start from
a new transformant?
How often does mutation occur in these strains?
Thanks a lot! |
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s********n
发帖数: 2939 | 8 Host strain Genotype
BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL strain E. coli B F– ompT hsdS(rB
– mB–) dcm+ Tetr gal λ(DE3) endA Hte [argU proL Camr] [argU ileY leuW
Strep/Specr]
BL21-CodonPlus-RIL strain3 E. coli B F– ompT hsdS(rB
– mB–) dcm+ Tetr gal endA Hte [argU ileY leuW Camr]
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL strain3 E. coli B F– ompT hsdS(rB
– mB–) dcm+ Tetr gal λ(DE3) endA Hte [argU ileY leuW Camr]
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-X strain3 E. coli B F– ompT hsdS(rB
– mB–) dcm+ Tetr gal λ(DE3) endA metA::Tn5(kanr) Hte [ar... 阅读全帖 |
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f*********p
发帖数: 13 | 9 I do not think you fully understood my answer to your question yet. let me put
it this way.
what kind of BL21 are you using? BL21 has BL21 (DE3), (DE3) pLysS, ...
different subtypes. I assume that you are using DE3 related strains. DE3
strain has a lambda phage lysogenized in BL21 e.coli, on which there is a T7
polymerase gene under the control of lac promoter. when you grow the cells up,
no or very little T7 pol can be expressed. when you add IPTG, it induces the
expression of T7 pol, which the |
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j********o
发帖数: 2 | 10 BL21codon+ is indeed BL21 with a plasmid that expresses rare codons and
BL21(DE3)pLysS/E is indeed BL21 with a plasmid that expresses an enzyme that
degrade T7 polymerase to avoid leaky. Both plasmid are chlorepenicol
resistance. In inder to make codon plus in BL21(DE3)pLysS/E strain, drug
marker of one plasmid must be change and the system will become too
complicated - the strain resist to two drug, plus another drug marker for your
recombinant protein.
it.
are
is
no
of |
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j********o
发帖数: 2 | 11 Yes. Not only BL21codon plus, but almost all BL21s except BL21(DE3)pLysS/E are
leaky. pLysS/E encode enzyme that degrade T7 polymerase to avoid leaky.
In your case with many rare Arg codons, you have to use codon plus. So, it is
importment to avoid leaky? otherwise, just express with leaky if it does no
harm. |
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r****o
发帖数: 105 | 12 你这个问题我也碰到过。我是表达一个酶的一部分，用的是pET20b,
宿主菌柱是BL21(DE3). 表达出来的蛋白是包涵体，量很大，估计对细菌很
toxic.所以我transform BL21(DE3)的时候在板上硬是只长出了一个colony.
幸运的是可以表达蛋白。
所以你这个问题很正常，mutant之所以比wt更糟糕，也许是因为形成了包涵
体之类的东西。
我提不出什么更好的建议，只能建议你降低一下amp的浓度，说不定会有帮助。
pET系统的origin属于低拷贝，amp的浓度太高可能是菌落无法生长。
第二点比较麻烦一些。建议你先做一个阳性对照，扩增一个常见基因，证明
你的genomic DNA 没有问题。如果这个成功了，试一下touch down PCR好了。
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m**z
发帖数: 787 | 13 用BL21做克隆？不太可行吧？克隆应该还是在DH5a等类似的里面。在这些e.coli里面没
有leaky expression的问题，只有BL21才有这个问题吧
DE3
（2 |
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g*****y
发帖数: 6325 | 14 克隆是不能用bl21(de3)的。这个菌株有end3基因表达, 你用来测序的miniprep DNA很
容易被这个酶降解。推荐卖
bl21(DE3)gold. 这个菌株end3已经knock out了。
DE3
（2 |
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r****r
发帖数: 36 | 15 1. use C41 E. coli, which is BL21 derivative. remember to use plasmid
purification kit that can eliminate ENDONUCLEASE. Due to its BL21 background
, the copy number of your plasmids would be kept relatively low and thus the
"toxicity" might pose less negative effects on right colonies. C41 is also
used to express "toxic" proteins very often.
2. use lower antibiotics in 2YT plates for C41.
3. incubate at room-temperature. Large and toxic plasmids always take 2 days
to form colonies. Colonies appe... 阅读全帖 |
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p******b
发帖数: 379 | 16 好像BL21不适合用于质粒扩增， 一般表达才用BL21 |
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发帖数: 1 | 17 想用lamda red在BL21中敲一个基因，按照protocol，把pKD46转入BL21，很奇怪的是不
管用化转还是电转，涂板后都没有长出来，但是转其他的质粒都没有问题。对pKD46跑
胶和单酶切都没有问题，按照protocol所有incubation的温度都是30度。同时还试过E.
coli 另外的菌株BW25113也是出现同样问题。有人遇到过质粒转成这样的情况吗？多谢
！ |
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R*s
发帖数: 2041 | 18 1. never heard of measuring bacterial at OD546 and calculating as u
said below. We only do it at OD600.
2. What temperature you grow the cells? Hope it is 37, not 30.
BL21(DE3)Plyss does grow relatively slower than other E.Coli strains.
However, it is not as slow as yours.
3. In fact, 12 hours for your transformed culture to reach OD 0.8 is not
terribly slow. It usually take us 6-9 hours to do so.
4. Last suggestion, make sure your Amp and Chl concentration is correct.
Even if they are correct, |
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m***e
发帖数: 21 | 19 我觉得有一下几个原因不用E。COLI
1。 一般的E。COLI细菌用的CODON PREFERENCE可能与MAMALIAN CELL不同，所以你用普通
的BL21的话可能蛋白根本不表达，但是这点可以克服，你可以用那种加入了RARE CODON的
CELL LINE，比如ROSETTA GEMI系列。
2。有一些MAMALIAN PROTEIN是需要表达后修饰才有活性的，而E。COLI可能无法提供这种
环境。
3。但是也有很多人用E。COLI表达真和生物蛋白，有时也能成功，但YEAST其实是一种挺
好的表达环境，比在FLY，或者作细胞培养方便多了。
所以建议你试一下用E。COLI，不行的话想办法提高YEAST中的产量。至少我知道不同培养
液对E。COLI表达量影响很大，可能你也可以换其他培养夜养YEAST。 |
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D****s
发帖数: 5 | 20 要表达一个全长40KD的蛋白，用的是pET32a+ vector. 转化入BL21(DE3) bacteria.
Western 显示full-length protein只有大约10%， 主要被降解成2条非常强的band.
而只表达这个蛋白的fragment（大约一半，20KD), 就没有蛋白降解的发生。
请问有什么好的建议？谢谢 |
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j*****a
发帖数: 92 | 21 拿有我insert DNA的recombinant plasmid(pRSet A)去测序，１００ ％ 符合。（我的
insert有1.０ kb），transform into BL21(DE3)pLysS Competent Cells 用His柱子纯
化蛋白. SDS-PAGE显示分子量20 kDa, 应该是35 kDa. 谢谢高手们回答。 |
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j*****a
发帖数: 92 | 22 谢谢大家的分析。我的insert DNA是N-His tag。 如果是翻译提前终止或降解，有什么
方法补救吗？
背景：拿有我insert DNA的recombinant plasmid(pRSet A)去测序，１００ ％ 符合。
（我的insert有1.０ kb），transform into BL21(DE3)pLysS Competent Cells 用His
柱子纯化蛋白. SDS-PAGE显示分子量20 kDa, 应该是35 kDa. |
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F*******g
发帖数: 44 | 23 老板让用minimal medium养菌做同位素标记，生物菜鸟一只……
按照分子克隆上的配方配料M9 medium，挑了单克隆可以摇起来，但接种之后吸光度长
到0.1就不长了，不知道是不是我的使用方法有什么问题
菌是BL21
谢过了 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 24 以感受态细胞为例
买一盒TOP10，十管的，要$200
你做一次感受态细胞，可以TOP10,DH5alpha，BL21都做上
用一天
就算你是postdoc，这一天的工作至少够实验室用一年的了
要说什么盯着点去离心
做生物实验的这样很平常吧
我的意思就是说，如果有钱，实验室无所谓，老板无所谓，那就随便花呗
但是养成了习惯，以后如果自己开实验室，甚至自己开公司，再或者忽然一夜之间经费
紧张了，那很
难改过来吧
我也不是说什么都要home made
就是有些随手能省的，比如配个LB，称3次而不用只称一次的配好的mix，好习惯的话就
随手省了呗
再比如如果实验室里什么药品快没了，提前定起来；几个公司的东西一起定；而不是到
了临头要求
rush order，overnight shipping，长久下来很多shipping的钱就省下来了，用这个多
买点
药品多做些实验不好么
sigh，也许我是从个比较节俭的实验室出来的，习惯了
掉了 |
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a***e
发帖数: 1010 | 26 there is always T7 background expression. If that is a concern, try use
BL21(DE3)pLys |
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T**********t
发帖数: 1604 | 27 E.coli的BL21(DE3)pLysS strain。带的质粒是个小质粒，表达的蛋白不大，只有7kD，
没有细胞毒性。用的培养基是LB+M9 salts，抗生素是Amp+Chloramphenicol。关键是以
前摇菌（同一个strain）都没有这个问题，最近屡屡出现，我不知道是哪里
contaminate了，如果是phage的话，就恐慌了，据说很难清除phage。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 28 最近用FseI切一个质粒
有两个位点
可是只有一个能切
所以很清楚不是反应里有inhibitor的问题
但是不能切的那个地方序列里也没有找到dam,dcm位点
对甲基化不是很了解
请高人帮忙看看下面这个序列是不是会被block
（FseI site在括号里）
另外准备转到BL21里再纯化（是dcm mutant吧？）
会不会有帮助呢？
ATTCGCCCTTTTA（GG^CCGGCC）GCCAGTGTGCTGGAATT |
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b********c
发帖数: 161 | 29 invitrogen pEXP5-NT/TOPO vector 和 BL21(DE3)Star competent cell
细胞长到 OD600=0.6~0.8时加入IPTG (final C=0.5mM)诱导表达, 25C和37C都试过,时
间点为2h, 4h 和6h. 然后提纯蛋白和跑SDS-PAGE：诱导前，诱导后，提纯后.
由于T7的leaky expression,我仍然提纯到了我需要的蛋白,关键问题是蛋白的量在IPTG
诱导前和诱导后没有变化。请问到底是哪个环节出错了呢？ |
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H****s
发帖数: 301 | 30 现在在尝试用原核系统（E.coli)表达一个病毒蛋白（400aa)，T7 promoter，BL21(DE3
) host。现在遇到了一个难题，这个基因怎么也克隆不到原核表达载体里去。转化后有
colonies，但是小提质粒后发现没有插入片段。
首先排除的是克隆问题，同样的片段，同样的酶切位点，使用完全同样的试剂，该基因
很容易就克隆到真核表达载体里去。
尝试了cytoplasm表达载体，periplasm表达载体,和不同的宿主菌，都是同样的结果。
（原核表达老手了，头一次遇到这种情况）。
是不是此蛋白毒性太大，即使是一点点的leaky expression都不行？
我现在在想的试验是：（1）做一个这个基因的文库，来看看到底是哪部分有毒性；（2
）使用GroES的leader peptide试试看。
各位有没有什么建议？谢谢。 |
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h**********8
发帖数: 650 | 31 猛男，你先用TOP10搞清楚质粒，再去BL21表达蛋白
DE3
（2 |
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n***w
发帖数: 2405 | 32 我最近也被蛋白表达的问题困扰着。
我设计了一个质粒，想表达一个fusion转录因子。但是从sds－page上来看，没有
overexpression的迹象，但是做wb，用该转录因子的抗体可以看到条带，虽然不多。用
gst, thrombin以后发现gst beads连上的是一个很小的片段，也就是说，表达的蛋白被
chop了，即使bl21是protease deficient的。。。
现在都不知道怎么办，应该用病毒表达这种full-length的？ |
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C*******e
发帖数: 4348 | 33 如果是codon bias
可以
1.用某些特殊的BL21(DE3)菌株，具体不记得哪些选择了，自己去搜一下
2.实在不行可以codon optimize，换成ecoli喜欢的codon
conditions |
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c*****t
发帖数: 198 | 34 T7 system and BL21, C43 cells
在 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 35 还好吧，他家的XL1-Blue和BL21一盒也就一百多刀，我一盒可以用很久了。我每个
transformation最多用20ul的感受态细胞，反正最后只需要一个单菌落。。。
自己做感受态细胞太麻烦了，做少了划不来，做多了又觉得浪费，用不了放-80吧，放
久了自己也不放心用，万一转化不成功也不知道是哪里出的问题，还是用新制备的或者
新买的放心。 |
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b********c
发帖数: 161 | 36 我老板说他以前也遇到过这种情况,就是完全不表达了,原因不详,所以我们就没有继续
用plys的了. |
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g*****y
发帖数: 6325 | 37 我最后是必须用plysS这个菌株的因
为这个菌株是从别的实验室拿来的还有另一个特别的属性是我需要的 |
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g*****y
发帖数: 6325 | 40 至今挑过2个。 都没有表达。。 打算在做一次transformation试试。 |
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n*********m
发帖数: 38 | 41 You can try low Temperature. But I think Cam is necessary for the induction. |
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n***w
发帖数: 2405 | 42 正在做蛋白表达，用的是rosetta-gami 2 DE3 plyss, 这里各种trouble shooting，我
喜欢～ |
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s********n
发帖数: 2939 | 43 你是指你用的这个带有pLysS的菌株是别人engineer过的，不是commercial的？
如果是这样的话他们应该会有原始不带pLysS的菌株，问问看。
如果实在不行的话，可以试试将这个菌株在不含Cm的培养基转接几次，然后划线在不含
Cm的平板，挑取单clone再分别划线于带有Cm和不含Cm的平板，这样估计你能找到丢失
pLysS质粒的菌株。 |
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g*****y
发帖数: 6325 | 44 不是不是， 是他们在novogen买了plysS的细胞然后又加了一种特性。我也是这么想的
。希望不要花太多时间。 还有你知
道那里有卖那种可以把一个板子上的colony复制到另一个板子上的那种film吗？ 我想
用这个方法可能筛选快点。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 47 有一个问题，万一你的蛋白不表达不是因为pLysS，而是因为这个另一个特别的属性呢
？如果是这样，那你就算把pLysS质粒想办法剔除了也还是一样解决不了问题啊。。。 |
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n***w
发帖数: 2405 | 48 I do glycerol stocks and expressed my protein for couples of times and at
this point, no mutations found. And honestly I do not know the answer... |
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T**********t
发帖数: 1604 | 49 Of course make glycerol stocks for those strains.
It's usually recommended to renew those stocks every 6 months. But I've used
frozen stocks of several years old and still got satisfactory expression. I
guess it may vary from case to case, though.
I would do small scale expression test each time before a large scale
expression culture if I'm worried about the quality of the frozen stock.
Just use a 5-ml culture and induce as how you would with a 1-L or larger
culture (scale down the amount of IP... 阅读全帖 |
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n***w
发帖数: 2405 | 50 Actually many protocols say high concentrations of IPTG can be used at
screening stage, up to 1mM.
used
I |
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