m******e
发帖数: 1932 | 1 求问：这两个机器哪个好？主要跑taqman和sybr，也有可能会用到hrm。这两天demo,
感觉Roche的在小amplicon上的well to well variation比biorad小，但amplicon大一
些, roche的well to well variation就大得多，而biorad不论Amplicon size，表现都
挺稳定。有经验的同学们请多多指教！谢谢！ |
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r**********e
发帖数: 587 | 2 另外，我只是对某个特定位点有兴趣，直接PCR就可以了，应该不需要next-gen seq，
毕竟不是whole-genome的work
关于您说的break frequency的问题，的确是个很好的问题
我用不同浓度的MMS来treatment，发现是有很明显的qPCR的Ct值的变化的。我的PCR
amplicon才是400bp；而其实很多人担心break frequency太低所以都是做10kb的
amplicon的PCR来增大sensitivity
repair |
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m*****6
发帖数: 19 | 3 看到最近Stephen Quake的review：
Single-cell genome sequencing: current state of the science
其中提到：
。。。 two quite similar hybrid methods have been
developed. Both of these methods use a limited isothermal amplification
followed by PCR amplification of
the amplicons generated during the isothermal step
(FIG. 2c). As the name implies, ‘displacement DOP-PCR’
(also known as PicoPLEX) uses degenerate primers in
the first step to add a common sequence, followed by
priming of the common sequence for subsequent... 阅读全帖 |
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j******i
发帖数: 939 | 4 我的文章用的方法 请生物信息的人帮我分析的
The indel frequencies were analyzed using CRISPResso (Pinello, 2015) using
the CRISPRessoPooled amplicons mode, while ignoring substitutions.
Alternatively, and for further validation, the HiSeq reads were trimmed with
Sickle (Joshi and Fass, 2011), merged with FLASH (Magoč and Salzberg,
2011), and mapped to the amplicons using bowtie2 (Langmead and Salzberg,
2012). Reads with an average Phred score below 23 were discarded. The reads
were then aligned using EMBOSS wate... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 5 第四类“重复” 验证实验信息：实名, 网络、论坛发布
- 重复、拓展验证实验不能支持NgAgo基因组编辑功能
暂只收录包含有具体实验信息（eg. 实验材料，步骤，etc）的发布报告
第二则
- 发布方：James Gagnon
- 发布时间：2016年7月8日至2016年7月29日
- 发布平台：google groups, twitter
- 发布方国家：美国
- 发布方城市：Cambridge, MA
- 发布方研究机构：Harvard University
- 实验室PI：Dr. Alex Schier
- NgAgo的来源：Addgene
o cloned into pCS2 vector for mRNA transcription, for use in zebrafish
- 应用验证实验结果:
o MiSeq PCR Amplicon高通量测序作为检测手段
o Twitter post “And no indels after amplicon MiSeq of NgAgo injected
... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 6 第四类“重复” 验证实验信息：实名, 网络、论坛发布
- 重复、拓展验证实验不能支持NgAgo基因组编辑功能
暂只收录包含有具体实验信息（eg. 实验材料，步骤，etc）的发布报告
第二则
- 发布方：James Gagnon
- 发布时间：2016年7月8日至2016年7月29日
- 发布平台：google groups, twitter
- 发布方国家：美国
- 发布方城市：Cambridge, MA
- 发布方研究机构：Harvard University
- 实验室PI：Dr. Alex Schier
- NgAgo的来源：Addgene
o cloned into pCS2 vector for mRNA transcription, for use in zebrafish
- 应用验证实验结果:
o MiSeq PCR Amplicon高通量测序作为检测手段
o Twitter post “And no indels after amplicon MiSeq of NgAgo injected
... 阅读全帖 |
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d***n
发帖数: 12 | 7 寻找Genomics方面的专家
我们也想借未鸣空间的宝地，公开求贤，寻找Genomics方面的专家，共同创业。
专业方向:
Next Gen DNA sequencing
Roche 454 Genome Sequencer FLX Standard and FLX Titanium
Solexa technology
Applied Biosystems SOLiD
Whole Genome Analysis
PCR Amplicon Sequencing
Metagenomics
Transcriptomics
Small RNA Analysis
Epigenetics
Genome sequencing and re-sequencing
ABI 3730xl, 3130xl
Amersham MegaBACE 4000 and 1000
文库构建
cDNA libraries (including standard cDNA library, large insert cDNA library,
normalized cDNA library and subtracted c |
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d***n
发帖数: 12 | 8 寻找Genomics方面的专家
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d***n
发帖数: 12 | 9 寻找Genomics方面的专家
我们也想借未鸣空间的宝地，公开求贤，寻找Genomics方面的专家，共同创业。
专业方向:
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Roche 454 Genome Sequencer FLX Standard and FLX Titanium
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cDNA libraries (including standard cDNA library, large insert cDNA library,
normalized cDNA library and subtracted c |
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m******n
发帖数: 194 | 10 everything you mentioned is considered, good comments, esp the last one
for example, unknown SNP/mutation in your primer region will
certainly change PCR efficiency. Or DNA modification might change
primer binding. If you are a biologist, you would think of these first.
DNA 2nd structure is certainly another thing to consider, esp. since my
amplicons are short (~70-150 bp). My student spent quite some time on
this aspect (quite some $ on software as well) and results are dubious.
For DNA 2nd str |
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e***o
发帖数: 344 | 11 版上各个领域的牛人不少，集思广益，大家来说说自己的一手心得体会吧，说不定这个
帖子就变成一个chapter了呢
各种病毒载体如 AAV,HSV,AV,VSV， Lenti,PRV,Rabies，还有 amplicon。。。。。都来说说
什么安全性，宿主细胞，表达效率，免疫原性，毒性，一起“研究研究” |
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s******s
发帖数: 13035 | 12 都是理论家。
实际上，pfu+taq能比Taq大概准确6倍，显然不是一部分Taq合成，一部分pfu合成
就能解释的。你要能证明就算pfu一点错误也不出，也只有1/6的amplicon是Taq
合成的，实际上Taq用量要比pfu高。
我的解释是，polymerase在体外合成DNA是一个dynamic的过程，尤其是错配以后，
会导致Taq的移位不顺畅，造成减速/甚至掉落，然后高保真酶就会上去用3->5
exo活性把错配切掉，继续合成。 |
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l******n
发帖数: 520 | 13 PCR amplicon纯化后再跑一个gel看看条带是不是很弱，如果很弱，要浓缩产物。尽可
能多加些模板DNA |
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o********r
发帖数: 775 | 14 现在还有人在分析NGS数据
Dear Colleague,
We are very pleased to announce the arrival of the second GAIIx sequencer at
Genotypic. We are now offering
- very short turnaround times
- and specializing in long reads >150 bases.
- we are also specializing in non standard applications like amplicon
sequencing and custom targeted captures and NGS data analysis.
www.nextgenseq.com
Our Genome informatics team is analyzing the Sequence data from IonTorrent -
E. coli O104:H4 (the European outbreak strain) and make th... 阅读全帖 |
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s******s
发帖数: 13035 | 15 是cDNA里面有重复，还是你的primer在重复区？
我以前p过一下里面无数重复序列的amplicon，没啥问题；要是你的primer有问题，
可以做一个nested, 外面p好克隆好，然后换你的引物 |
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n********k
发帖数: 2818 | 16 shall be an easy job---I would use fusion PCR---less sequencing and always
works...order two overlapping primers with the mutations in the middle, just
make sure there are at least 16-20bp on the 3 primer side. The overlapping
between the two primers (for fusion) should be at least 16-20bp too. Your
primer should be about 6-12bp+CagGcGA+18-20bp about 30-40bp for both primers
. try to keep the amplicons short 100-500bp. Longer is ok but need more
sequencing and also could get more challenging...... 阅读全帖 |
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l******n
发帖数: 520 | 17 16S rDNA amplicon sequencing |
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b*****o
发帖数: 150 | 18 1.2kb PCR 应该很容易扩增和克隆的。
不能扩出的原因：
引物设计有问题；amplicon GC含量过高；cDNA来源的组织没有或很低的表达, Go to
UCSC genome browser to check your gene's expression in different tissues,
also you can check your gene's isoforms.
克隆不出来的原因：
要扩增片段的一侧可能有你用来做克隆的酶切位点，建议比较没有切的回收片段和酶切
之后的片段；
建议你连到T载体上，然后测序。 |
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p********t
发帖数: 3639 | 19 大多时间都automation真的就是他们的广告！
chemistry part步骤真是烦琐，因为我们的starting material很少，不是gDNA,所以先
要amplify targeted amplicons,再make template pool, 接着做fragmentation,add
adapter, PCR, 还有size selection, 每一步都要beads purification!
从FUSION PCR开始才能用one touch, 而且从one touch 到PGM都不能high high
throughput, 一天最多做两个样品，而且PGM的initiation也很花时间，做完2个样品或
者12个小时不用就要wash,所有的buffer都要求是当天新鲜配置的。
还有就是更新太快，316chip还木有用完，318又刚RELEASE了。。。。。。。。。。。。
不过结果还是不错的！ |
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m***T
发帖数: 11058 | 20 你所提到的问题是你的samples量小而且是amplicon，所以操作会略复杂些，如果再做
target enrichement，自然步骤要多。所以这不是ION平台的问题，而是NGS领域共有的
问题。
至于更新换代快的情况，这就是仁者见仁、智者见智了。有人认为是好事，说明进步快
；有人则和你想得差不多。考虑到它是一个上市只有一年时间的新产品，更新快有情可
原。不过我也能理解你的frustration，过多的kits和protocls确实让不少人confuse。
。。 |
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n********k
发帖数: 2818 | 21 why u "have to" do one step RT-PCR? I am pretty curious...BTW, how long is your amplicon? for QPCR, best be below 150bp, something around 50-100bp would be good...virtually every pair works if one uses a reasonable software and pick the top choices...I use IDT's website to design it... |
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l**********1
发帖数: 5204 | 22 OMG
LZ used degenerated primer for cDNA single strand synthesis
R U Seriously? an amateur molecular biologist LZ?
Please go to
//www.protocol-
online.org/prot/Molecular_Biology/RNA/Reverse_Transcription__RT____cDNA_Synthesis/index.html
RT reaction is also called first strand cDNA synthesis. Three types of primers can be used for RT reaction:
oligo (dT) primers, random (hexamer) primers and gene specific primers with each having its pros and cons.
or
/media.affymetrix.com/support/technical/usb... 阅读全帖 |
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f*******e
发帖数: 628 | 23 都有错误，所以 illumina 454 啥的都要事先 sample amplification。这个 nanopore
既然号称不需要 sample prep, 就需要解决单分子测序的 error 问题。当然如果
sample 本来就是 amplicon 就无所谓了。
哪个文章？他们网站上说是有两种 mode，其中一种是用 exonuclease 的。我理解那个
strand sequencing 不用 nuclease，但是具体怎么 把 double strand 弄成 single
strand，然后 single strand 通过了之后如何 recover 不是太明白。
我没以为是单细胞测序，所以才说 error 要通过 coverage 来解决。而 PacBio 的某
个解决 error 方法是循环的重复测某一个单分子，这一点 Nanopore 好像做不到，因
为我的理解是某个 strand 通过测序之后被重复测的几率很低很低。这个 error 的问
题，特别在 sample 本身很少的情况下，比如一个 finger stick 的血样，不能解决的
话就是个问题。 |
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b****r
发帖数: 17995 | 24 sample amplification不是为了纠正错误吧？我记得一个是为了增大样品量，一个是为
了在amplicon两头加adaptor。amplification怎么纠正错误，你可否解释一下？
exonuclease干嘛用我确实也没看到，也许是把Mb级别的DNA搞成几十KB的，好一次测一
条吧
“某个 strand 通过测序之后被重复测的几率很低很低”，我在楼上帖解释了我的看法。
一个finger stick，那白细胞确实太少了，我不认为现在任何技术能很好地对其进行高
质量的NGS
nanopore
single |
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m***T
发帖数: 11058 | 25 非常好的讨论，学习了。对于双链的DNA，它似乎是用hairpin的方式来读取的。
它的优势大家已经讨论过了，从一个竞争者的角度来看，我来提点它存在的问题（至少
从目前看）。
1、对于一个今年下半年就要上市的产品，到现在都没有真正的data出来供大家参考。
它present的data太小，能不能scalable，如何能做到scalable后保持相同甚至更高的
accurate rate，是它要面临的一个大问题。
2、用protein做介质，稳定性能否保证。看介绍它们只能保证6个小时，临界情况下的
data quality如何，这个还得等到有了具体的data才能知道。
3、它依赖于长而完整的DNA来有效测量，那么对于一些短的sequences诸如short
amplicons及FFPE等临床样本则基本上没有用武之地。不知道这个是不是它的一个短板？
还有些其它的，但觉得这几点最重要。 |
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f*******e
发帖数: 628 | 26 第三点不是太明白。为什么 nanopore 依赖于长而完整的 DNA 来测量呢？Nanopore 在
测长的DNA 上面有优势，号称没有 read length 的上限，然而我没有找到导致它不能
测短的因素啊？比如几百个 bp 的 amplicon, 难道不能被 capture 来读取么？
板？ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 27 RE LZ
Did you read that Oxford nanopare NGS any relative paper? then replied with
below sentence?
1)
Nanopore 在
测长的DNA 上面有优势，号称没有 read length 的上限
2)
nanopore不用nuclease切DNA啊，你在哪里看到的。文章里明确说了，测完后还能
recover DNA的。它这个理论上就是靠DNA不同的碱基和那个pore蛋白的物理互作测序，
可能是氢键吧
3)
but now still has assembly problem
[ 47 ]
发信人: yuem0428 (ym), 信区: Biology
标 题: Re: 测序技术的重磅炸弹--Oxford Nanopore
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Feb 22 17:43:13 2012, 美东)
I would say there are two problems.
1. IT support. All previous sequencing data are from ... 阅读全帖 |
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f*****f
发帖数: 195 | 28 rt-pcr检测只能说明对应的amplicon存在于你的cDNA中。你要克隆的基因多大？cDNA文
库是如何制备的？仅仅用普通逆转录出来的文库往往丰度不高，而且很多都转录不完全
或是只能得到一些基因的片段。假如基因比较大的话很难pcr出来 |
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f*****f
发帖数: 195 | 29 首先ncbi上找到该基因 基因组序列和mRNA序列，
两个引物之间的intron越长越好。引物在exon和intron的边界最好，mRNA amplicon长
度我习惯设定100bp左右。
你可以下载一个perlprimer，有real-time pcr的选项，操作界面比较简单，你选择一
个引物看看在genomic/mRNA的哪个位置就应该大致明白了。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 30 无外乎两种基本方法吧
enrichment or amplicon sequencing
看你所关注区域的特点而定了 |
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a*******9
发帖数: 75 | 31 MiSEQ Amplicon sequencing is perfect for this kind of projects. You can
contact me for more detail information. |
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f*******2
发帖数: 14 | 32 What is the throughput you are looking for? If you only need about 30 to 50k
reads, Pacbio RS might also work for you. It can sequence the whole 1kb
amplicon with Sanger accuracy. Let me know if you need more info. |
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b****r
发帖数: 17995 | 33 1.5kb，理想的话一amplicon就扩了，从两头测，一边读800bp正好读完
一块板子送agencourt测，大概150刀，200个人5块板子搞完，加上试剂成本，大约一千
刀，2千怎么也打住了 |
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f*******2
发帖数: 14 | 34 对于LZ的项目，用PacBio的成本要比Sanger sequencing少。
multiplex是在PCR step. Barcodes can be added at the 5' end of both forward
and reverse primers for each sample. After PCR, purify and pool the
amplicons together with equal amount. Making one PacBio library with the
pooled sample and run one SMRT cell. Total price about 500 for PacBio
sequencing. The total throughput is about 100Mb per smrt cell with about 20-
50K reads.
LZ的200个PCR pool, 每个至少有100x coverage. 应该可以检测到50% or 100%突变. |
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j****x
发帖数: 1704 | 35 需要选取10-15个house keeping gene做amplicon resequencing，理想的应该是单拷贝
、非家族性的基因。请教在哪里/通过何种方式可以比较容易的确认呢？ |
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j****x
发帖数: 1704 | 36 需要设计50对基因组扩增引物，要求是PCR产物片段大小在2Kb左右，amplicon的GC
Content需要设定在48%上下浮动5%。自用的网上的引物设计工具都没有找到针对产物GC
Content的参数设定，哪位能给指点一下？
谢谢！ |
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j****x
发帖数: 1704 | 37 看来你基本没看懂这里PCR所指的意思，很明显是targeted amplicon sequencing，不
是你想象中的“普通PCR”。
至于说话语权，应该说在FDA手里。kit批了，相应的guideline自然就建立了，临床上
应用压根不存在什么人才瓶颈，这些在目前的为数不多的几种靶向药物突变检测的临床
应用中体现的很明显，或者说所有的IVD都差不多，多数时候对于clinician而言都不用
动脑子。 |
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l******u
发帖数: 936 | 38 http://investor.illumina.com/phoenix.zhtml?c=121127&p=irol-news
Illumina’s MiSeqDxTM Receives FDA Premarket Clearance with Two Cystic
Fibrosis Assays and Universal Kit for Open Use
Premarket Clearance is an Industry First for a Next-Generation Sequencing
System
SAN DIEGO--(BUSINESS WIRE)--Nov. 19, 2013-- Illumina, Inc. (NASDAQ:ILMN)
today announced that it received premarket clearance from the U.S. Food and
Drug Administration (FDA) for the MiSeqDx system, the first high-throughput
DNA sequencin... 阅读全帖 |
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z*t
发帖数: 863 | 39 circRNA平均有多大？
RT－qPCR的amplicon一般要在100-200bp之间，要知道back splicing的site才能设计RT
引物吧？ |
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s******y
发帖数: 17729 | 40 能说下大致薪水范围不？
网页上说了一堆就是没提薪水
Bioinformatics Analysis Engineer
Description
We have openings for skilled and experienced bioinformaticians who have expe
rience with Next-Generation Sequencing (NGS). These individuals will help de
sign, develop, optimize and characterize new clinical assays at Invitae. Suc
cessful candidates will join a growing team that is building robust infrastr
ucture, custom sophisticated algorithms and scalable analysis capabilities f
or clinical genetics. We use agile design an... 阅读全帖 |
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a******r
发帖数: 786 | 41 请问大家都怎么画那种PCR amplicon，在一个直线上取一段那种图？ |
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a******r
发帖数: 786 | 42 chip pcr 还是用percent input 比较好吧。倍数变化在pcr跟seq之间没办法做直接比
较。好像pcr的amplicon 无法直接跟测序的fragment做比较？
我对seq 经验有限，还请大仙来指教
chip |
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r**********e
发帖数: 587 | 43 顺便问一个问题
我做CHIP-PCR （qPCR之前先做standard PCR），但为啥连input都P不出条带呢？
input已经在gel检测过是有smear的
我能想到的就是：可能我的primer设计P出来的amplico size太长了。。。以为对于
sheared DNA作为模板大概也就300bp左右吧。。。我想请问各位primer design的
amplicon大概多长呢
thx |
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i*e
发帖数: 352 | 44 没有啥能100%万无一失的，BatchPD那个估计common SNPs都已经考虑了，rare的不清楚
，不过rare的话碰到的概率也小很多。此外individual个体还可能有未知的rare
variants，这个就更控制不了了。
看你之前所说，感觉是用来做validation不是detection的，所以万一有那么几个
readout不一致，换对引物或者用其他方法再验证一下。
我有可能记错，不错homopolymer和repeats在exons没有在3‘或者5’端频繁，有碰到
再分别单个手工设计引物好了。
我自己那个script，主要针对自己的实验目的，是WGS的variant validation，主要是
SNVs和小的Indels，也不单单是exonic，所以大多数面向exons的predesigned primers
就无用了，再说SNPs也没有被先排除。
设计引物的时候，input是VCF，已知的common和rare SNPs （dbSNP142）都有先
flagged，然后primer3的结果只取第一个output，之后in silico PCR再过一次，没过
的重新滚... 阅读全帖 |
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n******7
发帖数: 12463 | 45 这不就是amplicon/targeted sequencing吗
基本策略就两类 multiplex PCR 或者probe enrichment
各有优劣了 |
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s******r
发帖数: 1245 | 46 一个位点几块钱
amplicon不用考虑coverage，随便一个位点都是上千上万的，跑一个run本身不贵的可
能就1-2千，library prep那步成本差异比较大看用土豪还是钓丝做法 |
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s******r
发帖数: 1245 | 47 ion torrent的机器没什么人用了，都是用的illumina，miseq一个run出10-20m的reads
，5G的data，芯片本身也就一千多块，一万个位点做一个pool理论可行但保险点的还是
要上大机器，或者拆成几份跑
amplicon的library prep说到底就是个PCR |
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发帖数: 1 | 49 我想说的是为什么不把amplicon设计长一点 |
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t*****z
发帖数: 1598 | 50 amplicon sequencing，最简单最传统的二代测序。只要设计好针对该基因的引物就可
以测了。通过multiplexing，测序仪里一个洞可以塞很多样品。具体怎么操作问测序中
心就可以。 |
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