s**********a
发帖数: 92 | 1 之前发过相关问题帖子:
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31968723.html
现在正按照大家建议扩一个3kb的promoter， 然后连接到pGL3 or 4。
我的方法：引物两端加酶切位点，外面另有三个保护碱基。
1，Q5扩片段，跑胶证明分子量对，胶回收，双酶切，连接pGL，转化，无克隆。
2，Q5扩片段，Taq加A，连接T载体，转化，无克隆。
3，Taq扩片段，连接T载体，转化，无克隆。
大家帮我分析一下，问题出在哪里。难道是一开始的引物问题么？引物会有什么问题呢？
谢谢大家！ |
T*****e
发帖数: 247 | 2 看你的实验，你认为PCR没有问题，对吧。这种情况我可能会拿PCR产物测个序。确保确
实是你认为的序列。
TA cloning用的kit？ PCR结束之后怎么加的overhang？放了多久？有没有跑胶？哪一
步跑的胶？转化用的什么competent cell？
我的常规做法：
Q5扩增， 跑胶确定大小，胶纯化片段，用taq加3' overhang（PCR machine上72C
10min，然后4C，或者直接拿出来放冰上），然后立即做TA cloning （invitrogen的
kit），下面就是常规转化了
根据你的描述，我不知道你TA克隆前PCR产物放了多久，有没有过胶，有没有冻。我们
实验室一哥们说这些都会让overhang掉下来，我不知道是否真的如此。不过我这一套流
程从来没有失败过（如果competent cells没有问题的话） |
f*********t
发帖数: 273 | 3 酶切之后回收一下
之前发过相关问题帖子:http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31968723.html" x-a........
【在 s**********a 的大作中提到】
: 之前发过相关问题帖子:
: http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31968723.html
: 现在正按照大家建议扩一个3kb的promoter， 然后连接到pGL3 or 4。
: 我的方法：引物两端加酶切位点，外面另有三个保护碱基。
: 1，Q5扩片段，跑胶证明分子量对，胶回收，双酶切，连接pGL，转化，无克隆。
: 2，Q5扩片段，Taq加A，连接T载体，转化，无克隆。
: 3，Taq扩片段，连接T载体，转化，无克隆。
: 大家帮我分析一下，问题出在哪里。难道是一开始的引物问题么？引物会有什么问题呢？
: 谢谢大家！
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b*****s
发帖数: 169 | 4 1.酶切后需要胶纯化再做连接
2.Q5之后要用PcR产物纯化kit纯化后再用Taq加A
3. T载体是pGEMT吧，有蓝色克隆吗？没有的话就是你的载体或是感受态细胞有问题，
或是抗生素用错了。
你的PCR有你想要的条带，一般不会是引物设计的问题了。
另外建议用0.5ul T 载体，10xligase buffer，加ligase，然后加的PcR胶纯化产物至
最终体积，4度过夜
祝好运！ |
s**********a
发帖数: 92 | |
s********r
发帖数: 312 | 6 Use DNA concentration kit to purify your PCR product, elute in 45ul of H2O,
check concentration. Then cut PCR product for 3 hours, gel purify, ligate
and transform. |
x********e
发帖数: 35261 | 7 PCR之后TA ligation
如果这都不成功就要考虑片段是否有毒性了
呢？
【在 s**********a 的大作中提到】
: 之前发过相关问题帖子:
: http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31968723.html
: 现在正按照大家建议扩一个3kb的promoter， 然后连接到pGL3 or 4。
: 我的方法：引物两端加酶切位点，外面另有三个保护碱基。
: 1，Q5扩片段，跑胶证明分子量对，胶回收，双酶切，连接pGL，转化，无克隆。
: 2，Q5扩片段，Taq加A，连接T载体，转化，无克隆。
: 3，Taq扩片段，连接T载体，转化，无克隆。
: 大家帮我分析一下，问题出在哪里。难道是一开始的引物问题么？引物会有什么问题呢？
: 谢谢大家！
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n*******d
发帖数: 41 | 8 参照in-fusion克隆的原理设计引物，不用买in-fusion试剂盒。
将vector和insert pcr出来，混合，用dpnI消化一下去掉原载体，接着无需其他操作。
然后trans dh5a转化，
接着祈祷大肠杆菌神能顺利将这两个片段重组！
然后，colony pcr，菌神将保佑你得到正确的阳性克隆。 |
n*******d
发帖数: 41 | 9 如果载体pcr时，模板加太多，造成dpnI消化不掉原载体的话，你将无法得到菌神的庇
佑！
：参照in-fusion克隆的原理设计引物，不用买in-fusion试剂盒。
：将vector和insert pcr出来，混合，用dpnI消化一下去掉原载体，接着无需其他操作
。然后trans dh5a转化， |
T*****e
发帖数: 247 | 10 模板确实是个关键因素。Q5不喜欢太多的模板，而Taq忍耐性更强一点。不过楼主PCR似
乎没有问题。
我喜欢你这句"你将无法得到菌神的庇佑！" 看来你很enjoy实验 |
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n*******d
发帖数: 41 | 11 我九楼的内容指的是我在八楼提到的克隆方法的应该注意的点。
此法仅靠菌神做重组就可以，不需要额外加重组酶，不需要酶切连接步骤！
我个人本是非常enjoy实验的，只可惜目前跟ap老板观点总相左，正被老板疏远中！
：模板确实是个关键因素。Q5不喜欢太多的模板，而Taq忍耐性更强一点。不过楼主PCR
似乎没有问题。
： |
x********e
发帖数: 35261 | 12 什么叫重组？NHEJ？这种插入方法两端不会有很多突变吗
PCR
【在 n*******d 的大作中提到】
: 我九楼的内容指的是我在八楼提到的克隆方法的应该注意的点。
: 此法仅靠菌神做重组就可以，不需要额外加重组酶，不需要酶切连接步骤！
: 我个人本是非常enjoy实验的，只可惜目前跟ap老板观点总相左，正被老板疏远中！
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: ：模板确实是个关键因素。Q5不喜欢太多的模板，而Taq忍耐性更强一点。不过楼主PCR
: 似乎没有问题。
: ：
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n*******d
发帖数: 41 | 13 同源重组，反正目前没看到突变，所以应该不是NHEJ
菌神觉得NHEJ对他不重要
：什么叫重组？NHEJ？这种插入方法两端不会有很多突变吗
： |
H*******i
发帖数: 196 | 14 Linear DNA 转化？ 那必须是电转吧？
而且我记得大多数cloning strain都是recombinase不活跃的菌株啊
【在 n*******d 的大作中提到】
: 同源重组，反正目前没看到突变，所以应该不是NHEJ
: 菌神觉得NHEJ对他不重要
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: ：什么叫重组？NHEJ？这种插入方法两端不会有很多突变吗
: ：
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n*******d
发帖数: 41 | 15 不是电转，用的trans5a,确实不是每个公司的dh5a都能出
欢迎尝试大肠菌神教克隆大法，
克隆大法好！
：Linear DNA 转化？ 那必须是电转吧？
：而且我记得大多数cloning strain都是recombinase不活跃的菌株啊 |
x********e
发帖数: 35261 | 16 有片段大小的限制吗？如果这么容易克隆我干嘛做recobineering啊
【在 n*******d 的大作中提到】
: 不是电转，用的trans5a,确实不是每个公司的dh5a都能出
: 欢迎尝试大肠菌神教克隆大法，
: 克隆大法好！
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: ：Linear DNA 转化？ 那必须是电转吧？
: ：而且我记得大多数cloning strain都是recombinase不活跃的菌株啊
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n*******d
发帖数: 41 | 17 我们实验室最大的做过七八k的
克隆大法好，欢迎皈依我教
：有片段大小的限制吗？如果这么容易克隆我干嘛做recobineering啊
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x********e
发帖数: 35261 | 18 质粒有要求吗？ 我试试，如果有幸得大神庇佑，我就无脑入教了
【在 n*******d 的大作中提到】
: 我们实验室最大的做过七八k的
: 克隆大法好，欢迎皈依我教
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: ：有片段大小的限制吗？如果这么容易克隆我干嘛做recobineering啊
: ：
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n*******d
发帖数: 41 | 19 基本上唯二的要求就是
1，p亮点，越亮越容易出。2，p载体的时候模板加少点，少于100pg，不然dpni切不干
净,假阳性多。
有paper报道过这个方法，只是目前我找不到了。
欢迎无脑入教，将本教克隆大法发扬光大。哈哈哈哈！
：质粒有要求吗？ 我试试，如果有幸得大神庇佑，我就无脑入教了
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C*******4
发帖数: 400 | 20 你PGL3酶切以后有小片段出来和跑胶纯化没有？PCR引物在5端有没有留足够的碱基？有
些要3个才能有效切开。
Q5扩增很猛，可能你3K的片段在和Vector混合的比例不对。
T4LIGASE或者它的BUFFER 里的ATP没了都有可能造成转化不出克隆。
酶切点是甲基化不敏感类型吗？ |
