v**********t
发帖数: 9 | 1 最近从某公司订了synthesized peptide，但是似乎不纯。
请问如何确定50aa左右的peptide的纯度？
谢谢!! |
v**********m
发帖数: 5516 | 2 RP HPLC
【在 v**********t 的大作中提到】
: 最近从某公司订了synthesized peptide，但是似乎不纯。
: 请问如何确定50aa左右的peptide的纯度？
: 谢谢!!
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v**********t
发帖数: 9 | |
v**********m
发帖数: 5516 | 4 LCMS更好，定量经典做法是RPHPLC。
【在 v**********t 的大作中提到】
: Mass spec 可以吗？
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s******y
发帖数: 28562 | 5 对。
如果是混在一起的普通Mass Spec 不行的，因为对方公司会耍赖说普通质谱没有定量性。
【在 v**********m 的大作中提到】
: LCMS更好，定量经典做法是RPHPLC。
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K******S
发帖数: 10109 | 6 triple A analysis, all synthetic peptides should have AAA info.
【在 v**********t 的大作中提到】
: 最近从某公司订了synthesized peptide，但是似乎不纯。
: 请问如何确定50aa左右的peptide的纯度？
: 谢谢!!
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v**********t
发帖数: 9 | 7 这是他们给的图谱，纯吗？
各位懂得给看看。
谢谢。
【在 v**********m 的大作中提到】
: RP HPLC
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C******T
发帖数: 300 | 8 LCMS 和HPLC 都只能大致判断peptide的纯度，无法定量。
这两种方法（LC和HPLC）是依靠紫外峰估算peptide的含量。很多时候样品里的salt
and small molecule impurity不能依靠紫外吸收分析。业界认可的定量方法是楼上说
的AAA analysis。所谓 75%， 90% peptide content, 指的是AAA analysis 得到的数
据。
一个peptide经过HPLC提纯，看似纯度达到95%，做一下AAA analysis，发现peptide
content 只有50%，是很常见的事情。
不过楼上的样品，根据MS谱图来看，没有做AAA analysis的价值，太不纯了。50AA左右
的多肽，应该只有四五个峰。机器灵敏度不高的话，一般就是两三个峰。 |
v**********t
发帖数: 9 | |
K******S
发帖数: 10109 | 10 It's pretty standard procedure. It more depends on your peptide's sequence.
【在 v**********t 的大作中提到】
: 多谢！
: 哪个公司的service比较好？
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v**********m
发帖数: 5516 | 11 公司合成时会出specification，AAA通常是做过的，会给出(weight of多肽/weight of
样品)的纯度。那些一起干燥出来的小分子如醋酸盐等都会加重样品的表观重量。这个
只会对绝对浓度有影响,另外小分子对后续的生物实验影响不大，透析一下就可去除。
我觉得LZ应该是更关心多肽内部的纯度，合成步骤多时肯定有一些会少掉某些AA，那些
多肽杂质如果太多，会影响后续的生物研究。此类杂质只能用RP-HPLC鉴定，LCMS能更
一步的定性多肽杂质。这些多肽杂质和目的多肽性质理化接近，只能过制备柱进一步纯
化。
LZ的质谱图貌似MALDI-TOF，这个质谱样品的matrix非常杂，有些杂质也许是样品本身
带的，也可能是学校的facility质谱机器太脏导致的。如果能走LC-ESI-QTOF或TOF，基
本能确定多肽杂质在总多肽里所占的比例。
【在 C******T 的大作中提到】
: LCMS 和HPLC 都只能大致判断peptide的纯度，无法定量。
: 这两种方法（LC和HPLC）是依靠紫外峰估算peptide的含量。很多时候样品里的salt
: and small molecule impurity不能依靠紫外吸收分析。业界认可的定量方法是楼上说
: 的AAA analysis。所谓 75%， 90% peptide content, 指的是AAA analysis 得到的数
: 据。
: 一个peptide经过HPLC提纯，看似纯度达到95%，做一下AAA analysis，发现peptide
: content 只有50%，是很常见的事情。
: 不过楼上的样品，根据MS谱图来看，没有做AAA analysis的价值，太不纯了。50AA左右
: 的多肽，应该只有四五个峰。机器灵敏度不高的话，一般就是两三个峰。
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C******T
发帖数: 300 | 12 并不是所有公司会给出peptide content。据我的经验，纯度数据会免费提供。大部分
公司peptide content会额外收费，一般100左右，贵的可能会200到300。我同意你的说
法，LCMS可以给杂质定性。有两点我觉得可以商榷，第一，透析能不能去除盐。我们一
般先desalt, 然后HPLC提纯多肽（～95% pure)，然后做peptide content(假设70%)。
这25%的difference一般是多肽上结合的盐，比如TFA。众所周知多肽是以盐的结合体形
式提纯出来的。透析是不必要也是无益的。第二，多肽的不纯物当然会影响到结果。关
于小分子对生物学有没有影响，别的杂质不说，就举一个简单的TFA。业界的animal
study protocol，一般会要求避免多肽以TFA盐的形式进入动物体内，首选是acetate
salt，病理学毒性比TFA小 up to 30%。其他的小分子就更不用提了。TFA影响生物学的
例子我自己也见过一些。 |
l******a
发帖数: 3339 | 13 analytical HPLC
【在 v**********t 的大作中提到】
: 最近从某公司订了synthesized peptide，但是似乎不纯。
: 请问如何确定50aa左右的peptide的纯度？
: 谢谢!!
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v**********m
发帖数: 5516 | 14 赞内行，在csbio上班？
我记得治疗多肽在FDA那里用tfa和acn 或methanol都不行，都是用acetate和ethanol制
备tox 或GMP batch。
我记得有些lyo的样品可以用NH4HCO3 buffer透析，去掉其他盐，然后lyo的时候，NH3,
H2O,和CO2都会被抽走。不清楚结合在多肽上的tfa能否被这样的盐替换。
【在 C******T 的大作中提到】
: 并不是所有公司会给出peptide content。据我的经验，纯度数据会免费提供。大部分
: 公司peptide content会额外收费，一般100左右，贵的可能会200到300。我同意你的说
: 法，LCMS可以给杂质定性。有两点我觉得可以商榷，第一，透析能不能去除盐。我们一
: 般先desalt, 然后HPLC提纯多肽（～95% pure)，然后做peptide content(假设70%)。
: 这25%的difference一般是多肽上结合的盐，比如TFA。众所周知多肽是以盐的结合体形
: 式提纯出来的。透析是不必要也是无益的。第二，多肽的不纯物当然会影响到结果。关
: 于小分子对生物学有没有影响，别的杂质不说，就举一个简单的TFA。业界的animal
: study protocol，一般会要求避免多肽以TFA盐的形式进入动物体内，首选是acetate
: salt，病理学毒性比TFA小 up to 30%。其他的小分子就更不用提了。TFA影响生物学的
: 例子我自己也见过一些。
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C******T
发帖数: 300 | 15 对的。acetate 比较普遍。
多肽上的盐较好替换，用不同的酸，两到三次lyo可以换掉。
我是biologist，csbio应该没有我这样的职位。多谢垂询。 |
v**********t
发帖数: 9 | 16 感谢专家们的建议！
这个peptide确实比较长，60aa。因为是要用于structural study,所以比较关心全长
peptide在peptide总量中的百分比。盐的话可以替换。 |
