f*****h
发帖数: 228 | 1 版上大牛，我现在想分析一些non strand specific RNA-seq数据，不知道在用Bowtie
，TopHat，Cufflinks是都要注意些什么，另外，这些软件都是如何区分strand
specific和non specific的数据的，是正反strand都align上吗？还是在做
differential expression analysis的时候才考虑进去，本人初入门，多谢指教。 |
c*********r
发帖数: 1312 | 2 http://www.nature.com/nprot/journal/v7/n3/full/nprot.2012.016.h
我不是大牛，也是刚刚开始做NGS数据分析。上边这个link是个很好的Bowtie Tophat
Cufflinks pipeline。你可以参考一下，跟着做不太难。
就我的理解，non strand specific基本没问题，现在大多数RNA-seq数据好像都是默认
non strand specific。往往strand-specific才需要在分析时额外加一些option。
有空多交流。happy data mining！
Bowtie
【在 f*****h 的大作中提到】
: 版上大牛，我现在想分析一些non strand specific RNA-seq数据，不知道在用Bowtie
: ，TopHat，Cufflinks是都要注意些什么，另外，这些软件都是如何区分strand
: specific和non specific的数据的，是正反strand都align上吗？还是在做
: differential expression analysis的时候才考虑进去，本人初入门，多谢指教。
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f*****h
发帖数: 228 | 3 多谢啊
【在 c*********r 的大作中提到】
: http://www.nature.com/nprot/journal/v7/n3/full/nprot.2012.016.h
: 我不是大牛，也是刚刚开始做NGS数据分析。上边这个link是个很好的Bowtie Tophat
: Cufflinks pipeline。你可以参考一下，跟着做不太难。
: 就我的理解，non strand specific基本没问题，现在大多数RNA-seq数据好像都是默认
: non strand specific。往往strand-specific才需要在分析时额外加一些option。
: 有空多交流。happy data mining！
:
: Bowtie
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d****7
发帖数: 109 | 4 Non-strand specific就不用说了，最简单了，照着protocol来，没啥问题，问题在于
strand specific:
1. strand-specific or not 不影响mapping，因为不管用什么protocol，出来的reads
map到哪条strand都算。再算gene expression的时候才会用到strand information，
具体怎么count reads to gene, 这个要取决于你的strand specific library prep
protocol
2. 拿tophat/bowtie来说，mapping的时候有一个选项--library-type，这个怎么选都
不影响mapping，但是一定要注意，接下来用cuffilink/cuffdiff和htseq-count之类的
，这个--library-type一定要添对了，这个影响gene expression的counting
3. 如何选--library-type？总的来说，如果先测序的reads(R1 reads)是从first-
strand (first strand cDNA which is complementary to mRNA strand), 在cufflink
, cuffdiff, cuffquant和cuffnorm里就选fr-firststrand，在htseq-count里用"-s
reverse"选项；如果R1 reads是从mRNA strand上来的，那么cuff里边用fr-
secondstrand，在htseq-count里用“-s yes”选项。
现在的大多数protocol，如Illumina Truseq stranded mRNA kit (dUTP methods) 和
SENSE kit，都是fr-firststrand, 其他的我不太了解，需要看看library prep的
manual，看看先测first strand还是先测mRNA strand，是在搞不明白，就看别人是怎
么弄的，或者问你所用kit的生产公司，一般会告诉你的
Bowtie
【在 f*****h 的大作中提到】
: 版上大牛，我现在想分析一些non strand specific RNA-seq数据，不知道在用Bowtie
: ，TopHat，Cufflinks是都要注意些什么，另外，这些软件都是如何区分strand
: specific和non specific的数据的，是正反strand都align上吗？还是在做
: differential expression analysis的时候才考虑进去，本人初入门，多谢指教。
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