s*******g
发帖数: 36 | 1 想把protein immobilized到sensor chip上，用biacore或者octet Red做screen。。。
可是问题是我label的蛋白一直load不上去，load到的信号非常低。。。。 我用了
maleimide-PEG4-biotin 去label cysteine，结果一直不好。信号就是很低的时候就达
到平衡了，很奇怪。 之后我换成NHS-LS-biotin，这个大家用的比较多，结果load的信
号更低。。 我都有BSA去test labeling，都信号很低。。
我现在的问题是，蛋白肯定是label了，30%左右，我用的1 biotin： 1 protein的
ratio做的labeling，因为不想over label multiple sites on one protein. 都做了
两个月了，快绝望了。。。什么条件都试了，Octet red的信号就是不行！
另外，有人说BSA 不好label，想问问别人有用其他蛋白label的吗，我想做个positive
control， 说明是蛋白的问题，还是label的方法的问题
有经验的人指点一下吧。谢谢了！ |
D****o
发帖数: 80 | 2 Biacore为什么不直接用biotin tagged protein（Avi tag或者BioEase tag)?
chemical labeling 问题多多，重复性和特异性差，标记位点的heterogeneity导致信
号差，导致蛋白unfold，影响ligand binding... |
s******y
发帖数: 28562 | 3 我很久以前也作过一个类似的实验，感觉和你差不多。后来干脆就不去折腾这个方法了
直接换了6xHis 来做。
我现在也还是不明白当时为什么没有做出来。
positive
【在 s*******g 的大作中提到】
: 想把protein immobilized到sensor chip上，用biacore或者octet Red做screen。。。
: 可是问题是我label的蛋白一直load不上去，load到的信号非常低。。。。 我用了
: maleimide-PEG4-biotin 去label cysteine，结果一直不好。信号就是很低的时候就达
: 到平衡了，很奇怪。 之后我换成NHS-LS-biotin，这个大家用的比较多，结果load的信
: 号更低。。 我都有BSA去test labeling，都信号很低。。
: 我现在的问题是，蛋白肯定是label了，30%左右，我用的1 biotin： 1 protein的
: ratio做的labeling，因为不想over label multiple sites on one protein. 都做了
: 两个月了，快绝望了。。。什么条件都试了，Octet red的信号就是不行！
: 另外，有人说BSA 不好label，想问问别人有用其他蛋白label的吗，我想做个positive
: control， 说明是蛋白的问题，还是label的方法的问题
|
c****u
发帖数: 584 | 4 NHS ester label BSA 效率应该很高啊。你都有30％了. 会不会是biocore灵敏度低.
或非特异高？
positive
【在 s*******g 的大作中提到】
: 想把protein immobilized到sensor chip上，用biacore或者octet Red做screen。。。
: 可是问题是我label的蛋白一直load不上去，load到的信号非常低。。。。 我用了
: maleimide-PEG4-biotin 去label cysteine，结果一直不好。信号就是很低的时候就达
: 到平衡了，很奇怪。 之后我换成NHS-LS-biotin，这个大家用的比较多，结果load的信
: 号更低。。 我都有BSA去test labeling，都信号很低。。
: 我现在的问题是，蛋白肯定是label了，30%左右，我用的1 biotin： 1 protein的
: ratio做的labeling，因为不想over label multiple sites on one protein. 都做了
: 两个月了，快绝望了。。。什么条件都试了，Octet red的信号就是不行！
: 另外，有人说BSA 不好label，想问问别人有用其他蛋白label的吗，我想做个positive
: control， 说明是蛋白的问题，还是label的方法的问题
|
n********e
发帖数: 1630 | 5 我的蛋白是dimer AVITAG 就会每个蛋白两个tag 这样我们不希望 因为可能会把蛋白
结构改变 如果有两个都去跟SA binding
【在 D****o 的大作中提到】
: Biacore为什么不直接用biotin tagged protein（Avi tag或者BioEase tag)?
: chemical labeling 问题多多，重复性和特异性差，标记位点的heterogeneity导致信
: 号差，导致蛋白unfold，影响ligand binding...
|
n********e
发帖数: 1630 | 6 感觉大家都用NHS label 就是一个反应 就是重复性差 只要有一点蛋白被label了
就可以结合到chip上。。
我现在想找个蛋白做positive control 先把label的问题结决。。BSA label后也一直
load不上去。。。可以我用仪器公司的人提供的label的 carbonic anhydrase
loading 非常好。。所以我怀疑还是label发生了变化。
【在 s******y 的大作中提到】
: 我很久以前也作过一个类似的实验，感觉和你差不多。后来干脆就不去折腾这个方法了
: 直接换了6xHis 来做。
: 我现在也还是不明白当时为什么没有做出来。
:
: positive
|
n********e
发帖数: 1630 | 7 我用别人label好的蛋白 load特别好。。我现在做的是octet red. 我蛋白很纯
【在 c****u 的大作中提到】
: NHS ester label BSA 效率应该很高啊。你都有30％了. 会不会是biocore灵敏度低.
: 或非特异高？
:
: positive
|
a*****n
发帖数: 2835 | 8 after labeling, did you get rid of the free biotin molecule? The free biotin
will compete with the labeled protein and it is more abundant.
【在 n********e 的大作中提到】
: 我用别人label好的蛋白 load特别好。。我现在做的是octet red. 我蛋白很纯
|
n********e
发帖数: 1630 | 9 yes. i did dialysis 500x twice to remove free labels. that's also what other
people do after labeling.
biotin
【在 a*****n 的大作中提到】
: after labeling, did you get rid of the free biotin molecule? The free biotin
: will compete with the labeled protein and it is more abundant.
|
c****u
发帖数: 584 | 10 找个过期的antibody 作positive test吧。 NHS 是标抗体最常用的办法。
other
【在 n********e 的大作中提到】
: yes. i did dialysis 500x twice to remove free labels. that's also what other
: people do after labeling.
:
: biotin
|
|
|
T**********t
发帖数: 1604 | 11 你是用6xhis tagged的蛋白load在biacore的芯片上做么？
我们也想这么做，但是facility的人强烈不建议，说是NTA的biacore芯片表现很不好，
我们学校之前好多个组试过，没一个做出来结果是好的。现在我很苦逼的要把avitag
construct到我的蛋白上重新表达再标记biotin。。。
【在 s******y 的大作中提到】
: 我很久以前也作过一个类似的实验，感觉和你差不多。后来干脆就不去折腾这个方法了
: 直接换了6xHis 来做。
: 我现在也还是不明白当时为什么没有做出来。
:
: positive
|
s******y
发帖数: 28562 | 12 没有没有，我那个时候还没有biacore 这么牛叉的东西呢。我其实就是要把一个蛋白固
定在一个表面上来做biophysical experiment 而已
【在 T**********t 的大作中提到】
: 你是用6xhis tagged的蛋白load在biacore的芯片上做么？
: 我们也想这么做，但是facility的人强烈不建议，说是NTA的biacore芯片表现很不好，
: 我们学校之前好多个组试过，没一个做出来结果是好的。现在我很苦逼的要把avitag
: construct到我的蛋白上重新表达再标记biotin。。。
|
s********n
发帖数: 2939 | 13 不至于吧，BIAcore很早就有了吧，可能你们不用而已
【在 s******y 的大作中提到】
: 没有没有，我那个时候还没有biacore 这么牛叉的东西呢。我其实就是要把一个蛋白固
: 定在一个表面上来做biophysical experiment 而已
|
l****y
发帖数: 398 | 14 直接上CM5 chip.
positive
【在 s*******g 的大作中提到】
: 想把protein immobilized到sensor chip上，用biacore或者octet Red做screen。。。
: 可是问题是我label的蛋白一直load不上去，load到的信号非常低。。。。 我用了
: maleimide-PEG4-biotin 去label cysteine，结果一直不好。信号就是很低的时候就达
: 到平衡了，很奇怪。 之后我换成NHS-LS-biotin，这个大家用的比较多，结果load的信
: 号更低。。 我都有BSA去test labeling，都信号很低。。
: 我现在的问题是，蛋白肯定是label了，30%左右，我用的1 biotin： 1 protein的
: ratio做的labeling，因为不想over label multiple sites on one protein. 都做了
: 两个月了，快绝望了。。。什么条件都试了，Octet red的信号就是不行！
: 另外，有人说BSA 不好label，想问问别人有用其他蛋白label的吗，我想做个positive
: control， 说明是蛋白的问题，还是label的方法的问题
|
s******y
发帖数: 28562 | 15 我做研究生时候得实验室穷啊。哪里买得起那么高大上得仪器？ 第一次见到真实的仪
器是博士后的时候
【在 s********n 的大作中提到】
: 不至于吧，BIAcore很早就有了吧，可能你们不用而已
|
e****y
发帖数: 129 | 16 不应该啊？我在octetred上用过超过20个protein，都很好。你说的很低是多低呢？1：
1的NHS-LS-biotin，PBS buffer，4 degree 2 hours，followed by 500mlx3 (2 hours
, 2 hours, and over night) dialysis to remove unreacted biotin.这个一定要去
干净，要不immobilization会很差，哪怕一点点，这个是小分子，比protein
immobilizationxiaolv高很多。
positive
【在 s*******g 的大作中提到】
: 想把protein immobilized到sensor chip上，用biacore或者octet Red做screen。。。
: 可是问题是我label的蛋白一直load不上去，load到的信号非常低。。。。 我用了
: maleimide-PEG4-biotin 去label cysteine，结果一直不好。信号就是很低的时候就达
: 到平衡了，很奇怪。 之后我换成NHS-LS-biotin，这个大家用的比较多，结果load的信
: 号更低。。 我都有BSA去test labeling，都信号很低。。
: 我现在的问题是，蛋白肯定是label了，30%左右，我用的1 biotin： 1 protein的
: ratio做的labeling，因为不想over label multiple sites on one protein. 都做了
: 两个月了，快绝望了。。。什么条件都试了，Octet red的信号就是不行！
: 另外，有人说BSA 不好label，想问问别人有用其他蛋白label的吗，我想做个positive
: control， 说明是蛋白的问题，还是label的方法的问题
|
n********e
发帖数: 1630 | 17 多谢。终于找到明白人了。我dialysis没有那么多 。我用500x 1h Twice. 这个可能真
的不够。可能有free biotin在 。 下次我一定试试你的dialysis的方法。我octet 信
号才3-4 nm 有的时候更低。就是很低就饱和了。确实说明binding site没了。
另外我是label 4°C 过夜。这样就成了三天时间label一次了。。。
另外我用的是maleimide-PEG2-BIOTIN 50mM HEPES buffer. 标记SH group
另外我也有NHS -LC-BIOTIN... 本来想用BSA 去label做个control 结果bsa也load不
上去
听了你说的。我感觉真的要用更多的dialysis
待会私信再问你。谢谢啊。。。
hours
【在 e****y 的大作中提到】
: 不应该啊？我在octetred上用过超过20个protein，都很好。你说的很低是多低呢？1：
: 1的NHS-LS-biotin，PBS buffer，4 degree 2 hours，followed by 500mlx3 (2 hours
: , 2 hours, and over night) dialysis to remove unreacted biotin.这个一定要去
: 干净，要不immobilization会很差，哪怕一点点，这个是小分子，比protein
: immobilizationxiaolv高很多。
:
: positive
|
g*********5
发帖数: 2533 | 18 we bought the octec, 170000...
【在 s******y 的大作中提到】
: 我做研究生时候得实验室穷啊。哪里买得起那么高大上得仪器？ 第一次见到真实的仪
: 器是博士后的时候
|
g*********5
发帖数: 2533 | 19 Octec is better than biacore.
You could add avi tag to your protein DNA sequence and express it in the
mammalian cells(293T).
Octec company have the biotin tips, and you can purify the protein and use
the biotin tips directly. dont put biotin into your cells. It would be
copurified with your avitag protein and interfere the following binding
assay.
【在 n********e 的大作中提到】
: 多谢。终于找到明白人了。我dialysis没有那么多 。我用500x 1h Twice. 这个可能真
: 的不够。可能有free biotin在 。 下次我一定试试你的dialysis的方法。我octet 信
: 号才3-4 nm 有的时候更低。就是很低就饱和了。确实说明binding site没了。
: 另外我是label 4°C 过夜。这样就成了三天时间label一次了。。。
: 另外我用的是maleimide-PEG2-BIOTIN 50mM HEPES buffer. 标记SH group
: 另外我也有NHS -LC-BIOTIN... 本来想用BSA 去label做个control 结果bsa也load不
: 上去
: 听了你说的。我感觉真的要用更多的dialysis
: 待会私信再问你。谢谢啊。。。
:
|
n********e
发帖数: 1630 | 20 红色是仪器公司提供的label好的蛋白，蓝色是我自己label的蛋白。每次都是3-4nm，
有一次到了7nm，结果重新label了一批，又回到原来了。 另外我不希望用NaCl在我的
buffer里，这样会促进蛋白的oligomerization. 但是当我加了50mM NaCl之后，信号能
多个2-3 nm。。。 如果真的能达到10， 我也不需要加NaCl 追求13了。
hours
【在 e****y 的大作中提到】
: 不应该啊？我在octetred上用过超过20个protein，都很好。你说的很低是多低呢？1：
: 1的NHS-LS-biotin，PBS buffer，4 degree 2 hours，followed by 500mlx3 (2 hours
: , 2 hours, and over night) dialysis to remove unreacted biotin.这个一定要去
: 干净，要不immobilization会很差，哪怕一点点，这个是小分子，比protein
: immobilizationxiaolv高很多。
:
: positive
|
