P**F
发帖数: 18 | 1 已知一段DNA启动子序列，有什么办法知道都有什么蛋白结合在上面呢？ |
T*****e
发帖数: 247 | 2 你想知道什么样的蛋白结合？ sequence specific transcription factor? 还是别的？
你想用什么办法检测？in silico? 还是具体的实验？
这个问题太泛泛了吧 |
D**A
发帖数: 311 | 3 这种sequence specific DNA chromatography不容易做，会有很多杂蛋白粘在上面。 |
D**X
发帖数: 16 | 4 我有个启动子，想知道哪些蛋白/转录因子可以结合上去。不是预测，是确切知道是哪
些蛋白。
的？
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
【在 T*****e 的大作中提到】
: 你想知道什么样的蛋白结合？ sequence specific transcription factor? 还是别的？
: 你想用什么办法检测？in silico? 还是具体的实验？
: 这个问题太泛泛了吧
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D**A
发帖数: 311 | 5 合成含有你promoter的序列DNA, 弄个negative control, nick translation加上
biotin，pull down, mass spec, 得到上千个蛋白。我们实验室有人做过。
所以，目前没有很有效的方法。
【在 D**X 的大作中提到】
: 我有个启动子，想知道哪些蛋白/转录因子可以结合上去。不是预测，是确切知道是哪
: 些蛋白。
:
: 的？
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D**A
发帖数: 311 | 6 合成含有你promoter的序列DNA, 弄个negative control, nick translation加上
biotin，pull down, mass spec, 得到上千个蛋白。我们实验室有人做过。
所以，目前没有很有效的方法。
【在 D**X 的大作中提到】
: 我有个启动子，想知道哪些蛋白/转录因子可以结合上去。不是预测，是确切知道是哪
: 些蛋白。
:
: 的？
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D**X
发帖数: 16 | 7 这上千个蛋白里有没有真的特异结合的蛋白？是体内还是体外做的？
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
【在 D**A 的大作中提到】
: 合成含有你promoter的序列DNA, 弄个negative control, nick translation加上
: biotin，pull down, mass spec, 得到上千个蛋白。我们实验室有人做过。
: 所以，目前没有很有效的方法。
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D**A
发帖数: 311 | 8 当然会有，问题在于，你如何在这几千个蛋白里面找一个出来。还有，一些squence
specific transcription factor在体外在是不结合DNA的。
现在RNAi library那么普及，可以考虑用那个来筛。luciferase，大批量。
【在 D**X 的大作中提到】
: 这上千个蛋白里有没有真的特异结合的蛋白？是体内还是体外做的？
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
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T*****e
发帖数: 247 | 9 有几种办法：
1. in silico预测，我不知道你对这个基因了解多少，但你如果大概有点概念的话，几
个常见的信号通路你可以测试一下，筛一筛，运气好的话发现点什么，然后顺着这个信
号通路往下走，可能有几个转录因子，你就可以直接找它的
binding site了，然后你回来用实验验证：westernblot， immunostaining， q-PCR
， in situ hybridization等等
还有如果你那个细胞、组织已经有现成的chip-seq数据库，你也可以直接先找找看有没
有binding峰嘛
2. 构建reporter直接进行筛选，luciferase或荧光reporter都行，这个可以向1一样有
针对性的筛，也可以大规模的盲筛
3. yeast one hybridization 这个要看运气了
不知道大家有没有什么更好的办法，欢迎一起探讨 |
r**********e
发帖数: 587 | 10 这其实是个很重要的基本问题。
楼上有人说pull down sequence-bound protein然后上mass spec可以打出上千个蛋白
。表示有点惊讶。
我觉得第一步你可以去参考ENCODE project里的数据（ucsc browser里就有），一般
promoter区域都有NNN多的transcription factor binding，所以我估计你通过ENCODE
就可以找到很多有效信息。结合你研究的生物学pathway估计你也应该知道重要的TF,如
果能在ENCODE数据里看到那就非常promising。但注意，所有的epigenome的调控都是非
常tissue-specific的。ENCODE提供了大概9种cell line，很多时候具体到你的生物学/
医学问题，这9种cell line是完全不能说明问题的（尤其对于神经组织）
但anyway你是promoter区域，希望大大的有，比其他的noncoding区域容易做的多了。
in silico的我个人觉得特别不靠谱。。。有很多类似的预测网站。。不靠谱。
总之，基于protein找DNA, 相对于基于DNA找protein应该容易的多？
【在 T*****e 的大作中提到】
: 有几种办法：
: 1. in silico预测，我不知道你对这个基因了解多少，但你如果大概有点概念的话，几
: 个常见的信号通路你可以测试一下，筛一筛，运气好的话发现点什么，然后顺着这个信
: 号通路往下走，可能有几个转录因子，你就可以直接找它的
: binding site了，然后你回来用实验验证：westernblot， immunostaining， q-PCR
: ， in situ hybridization等等
: 还有如果你那个细胞、组织已经有现成的chip-seq数据库，你也可以直接先找找看有没
: 有binding峰嘛
: 2. 构建reporter直接进行筛选，luciferase或荧光reporter都行，这个可以向1一样有
: 针对性的筛，也可以大规模的盲筛
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D**A
发帖数: 311 | 11 实验室有人在做 的确是上千个蛋白
ENCODE
学/
【在 r**********e 的大作中提到】
: 这其实是个很重要的基本问题。
: 楼上有人说pull down sequence-bound protein然后上mass spec可以打出上千个蛋白
: 。表示有点惊讶。
: 我觉得第一步你可以去参考ENCODE project里的数据（ucsc browser里就有），一般
: promoter区域都有NNN多的transcription factor binding，所以我估计你通过ENCODE
: 就可以找到很多有效信息。结合你研究的生物学pathway估计你也应该知道重要的TF,如
: 果能在ENCODE数据里看到那就非常promising。但注意，所有的epigenome的调控都是非
: 常tissue-specific的。ENCODE提供了大概9种cell line，很多时候具体到你的生物学/
: 医学问题，这9种cell line是完全不能说明问题的（尤其对于神经组织）
: 但anyway你是promoter区域，希望大大的有，比其他的noncoding区域容易做的多了。
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D**A
发帖数: 311 | 12 实验室有人在做 的确是上千个蛋白
ENCODE
学/
【在 r**********e 的大作中提到】
: 这其实是个很重要的基本问题。
: 楼上有人说pull down sequence-bound protein然后上mass spec可以打出上千个蛋白
: 。表示有点惊讶。
: 我觉得第一步你可以去参考ENCODE project里的数据（ucsc browser里就有），一般
: promoter区域都有NNN多的transcription factor binding，所以我估计你通过ENCODE
: 就可以找到很多有效信息。结合你研究的生物学pathway估计你也应该知道重要的TF,如
: 果能在ENCODE数据里看到那就非常promising。但注意，所有的epigenome的调控都是非
: 常tissue-specific的。ENCODE提供了大概9种cell line，很多时候具体到你的生物学/
: 医学问题，这9种cell line是完全不能说明问题的（尤其对于神经组织）
: 但anyway你是promoter区域，希望大大的有，比其他的noncoding区域容易做的多了。
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R****n
发帖数: 708 | 13 有文章么？发来看看， THX
【在 D**A 的大作中提到】
: 合成含有你promoter的序列DNA, 弄个negative control, nick translation加上
: biotin，pull down, mass spec, 得到上千个蛋白。我们实验室有人做过。
: 所以，目前没有很有效的方法。
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k****l
发帖数: 279 | 14 yeast one hybrid 筛选
【在 P**F 的大作中提到】
: 已知一段DNA启动子序列，有什么办法知道都有什么蛋白结合在上面呢？
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P**F
发帖数: 18 | 15 谢谢楼上各位的建议和讨论！
我的设想如下：
1. 用已有的启动子（较弱）驱动一个报告基因，然后在此基础上构建一个library，
把random序列（6～8 bp ？）放在这个较弱启动子的前面并用某种化学物质（inducer
）处理，然后在in vivo筛选报告基因表达增强的克隆。目的是找到对此inducer有特异
反应的DNA序列。
2. 根据此DNA序列，寻找能够在体内情况下结合的蛋白，然后通过调节这些蛋白的表达
进一步增强报告基因的活性。
3. 最终目的是建立一个全新的系统，包括synthetic promoter和上游调控因子，能对
特殊的inducer（可以是任何环境影响，不限于化合物）具有超灵敏的反应。
不知大家对此设想有何高见？
【在 k****l 的大作中提到】
: yeast one hybrid 筛选
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H****s
发帖数: 301 | 16 这是个非常有趣但是很难回答的问题，因为未知因素或者说是不确定因素太多。比如说
，你的启动子有多大？学界对这个启动子的了解程度如何？有没有一些突变可以改变启
动子活性？根据这些信息你可以更进一步地来考虑你要做的事情。每一种技术都有它的
优点、缺点和局限性。考虑周全，路可以走得顺一些。举个例子，就酵母单杂交来说，
假设你不需要从头学起，假阳性也很高，后期的确认也非常花时间，并且不是所有的启
动子都可以放进这个系统的。
另外，可能话有点多，你是还在读学位的学生吗？如果是的话，对于你上面的研究计划
，我会说，去干吧，孩子。因为探索未知的乐趣远远大于解决问题的乐趣，何况你还在
training之中。如果你处于博士后研究阶段，我会说，看看有没有什么比较成熟的技术
可以使用，或者是看看花点钱找个CRO给做了，因为你所处职业发展的阶段不太适合从
头开始建系统，那是出力不讨好的事情。
inducer
【在 P**F 的大作中提到】
: 谢谢楼上各位的建议和讨论！
: 我的设想如下：
: 1. 用已有的启动子（较弱）驱动一个报告基因，然后在此基础上构建一个library，
: 把random序列（6～8 bp ？）放在这个较弱启动子的前面并用某种化学物质（inducer
: ）处理，然后在in vivo筛选报告基因表达增强的克隆。目的是找到对此inducer有特异
: 反应的DNA序列。
: 2. 根据此DNA序列，寻找能够在体内情况下结合的蛋白，然后通过调节这些蛋白的表达
: 进一步增强报告基因的活性。
: 3. 最终目的是建立一个全新的系统，包括synthetic promoter和上游调控因子，能对
: 特殊的inducer（可以是任何环境影响，不限于化合物）具有超灵敏的反应。
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T*****e
发帖数: 247 | 17 这个已经有人做了。希望我能找到看过的那篇文献。
你的设计概念上很好，但有几个小问题：
1. 为什么要用某种化学物质处理呢？你想要模拟某个细胞信号？或者单纯想找出一种
inducible的转录结合/诱导？你大概是想后者。我个人认为与其泛泛的筛选，不如根据
某个具体的发育/疾病环境进行筛选。
2.最后找到的目的是什么呢？即使你说你这个筛选的模式是全新的系统（姑且不论已经
有类似的文章发表了），你能直接找到的蛋白/DNA结合仍然是那个细胞体系/环境下固
有的。如果你不进一步优化这个蛋白的话，我很难想象如何推广这种应用。
一点浅见。
inducer
【在 P**F 的大作中提到】
: 谢谢楼上各位的建议和讨论！
: 我的设想如下：
: 1. 用已有的启动子（较弱）驱动一个报告基因，然后在此基础上构建一个library，
: 把random序列（6～8 bp ？）放在这个较弱启动子的前面并用某种化学物质（inducer
: ）处理，然后在in vivo筛选报告基因表达增强的克隆。目的是找到对此inducer有特异
: 反应的DNA序列。
: 2. 根据此DNA序列，寻找能够在体内情况下结合的蛋白，然后通过调节这些蛋白的表达
: 进一步增强报告基因的活性。
: 3. 最终目的是建立一个全新的系统，包括synthetic promoter和上游调控因子，能对
: 特殊的inducer（可以是任何环境影响，不限于化合物）具有超灵敏的反应。
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P**F
发帖数: 18 | 18 非常感谢你的诚恳建议！
我也考虑过酵母单杂交，但这个系统的问题一是这个库是否足够大，另一个是担心酵母
系统跟我做的物种太不相同。何况有的时候这种调控并不能由单一蛋白完成。
对我现在的启动子，学术界已经研究超过20年了，可以说很清楚了。我之所以选这个启
动子，其实主要是利用它来筛选我感兴趣的DNA短序列以及相应的调控机制，并不在现
有启动子本身。我知道这肯定会花很多时间跟精力，但是现在只是想了解一下有多大可
行性，也想在有限的时间内做些预备性的实验，为将来自己的方向打基础。
【在 H****s 的大作中提到】
: 这是个非常有趣但是很难回答的问题，因为未知因素或者说是不确定因素太多。比如说
: ，你的启动子有多大？学界对这个启动子的了解程度如何？有没有一些突变可以改变启
: 动子活性？根据这些信息你可以更进一步地来考虑你要做的事情。每一种技术都有它的
: 优点、缺点和局限性。考虑周全，路可以走得顺一些。举个例子，就酵母单杂交来说，
: 假设你不需要从头学起，假阳性也很高，后期的确认也非常花时间，并且不是所有的启
: 动子都可以放进这个系统的。
: 另外，可能话有点多，你是还在读学位的学生吗？如果是的话，对于你上面的研究计划
: ，我会说，去干吧，孩子。因为探索未知的乐趣远远大于解决问题的乐趣，何况你还在
: training之中。如果你处于博士后研究阶段，我会说，看看有没有什么比较成熟的技术
: 可以使用，或者是看看花点钱找个CRO给做了，因为你所处职业发展的阶段不太适合从
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