n**********u
发帖数: 77 | 1 我最近用promega的Gotaq酶做pcr，然后再TA克隆。 情况是这样的：我循环是40,后面
有10min 72度extension.但是就是连接不上，pcr product跑胶后的条带是很亮的。 我
怀疑是我的TA kit的问题，但是也不是，因为我把我的pcr products 中浓度较弱的几
个当作template再来一次short-pcr后（15cycles,然后10min 72度extension）得到的
产物回收再做TA克隆，得到满板。这说明我的TA克隆是正确的，就是pcr的问题。 我怀
疑是开始的循环数太多了，就降到35个循环，但是还是不行。 后来我又怀疑是我的酶
和体系出问题了，pcr的产物可能没有加上A尾，我加大酶量和dntp的量。 但是还是不
行。我后来又做了加A尾的实验，换了fermentas一般taq酶，也还是不行。大家说可能
是什么原因。
我的pcr体系：
20ul体系
H2O 9
5*GoTaq color buffer 4
dNTP（2mM） 2
mgcl2（25mM） 1.6
BSA（100mg/ml） 0.15
primer-F(20uM) 1
primer-R(20uM) 1
template 1
taq 0.25
Sum 20
primer是degenerated primer所以浓度高一点
这是我的pcr产物的胶图：
http://www.kuaipan.cn/file/id_5701964222495829.htm?source=1 | m******u
发帖数: 12400 | 2 基因致死？我也碰到过。有些基因是因为DNA序列本身就可以造成细菌伤害而无需基因
产物，所以连不转录翻译的也不计较插入方向的TA克隆都不行。 | x********e
发帖数: 35261 | 3 一直用promega的gotaq做TA, 跟你不同的是我不加氯化镁和BSA,最多34个cycle。跑胶
确定条带单一后我直接用1ul PCR产物做连接
会不会你盐浓度太高了,或者产物和质粒的比例不对
【在 n**********u 的大作中提到】
: 我最近用promega的Gotaq酶做pcr，然后再TA克隆。 情况是这样的：我循环是40,后面
: 有10min 72度extension.但是就是连接不上，pcr product跑胶后的条带是很亮的。 我
: 怀疑是我的TA kit的问题，但是也不是，因为我把我的pcr products 中浓度较弱的几
: 个当作template再来一次short-pcr后（15cycles,然后10min 72度extension）得到的
: 产物回收再做TA克隆，得到满板。这说明我的TA克隆是正确的，就是pcr的问题。 我怀
: 疑是开始的循环数太多了，就降到35个循环，但是还是不行。 后来我又怀疑是我的酶
: 和体系出问题了，pcr的产物可能没有加上A尾，我加大酶量和dntp的量。 但是还是不
: 行。我后来又做了加A尾的实验，换了fermentas一般taq酶，也还是不行。大家说可能
: 是什么原因。
: 我的pcr体系：
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