e*******e
发帖数: 342 | 1 最近用quick-change的方法构建library，测序后发现在靶向的位点都有突变，但是在
该位点后面都有多出来的引物重复序列。
我所使用的方法及引物的设计是按照Stratagene的QuickChange Site-directed
mutagenesis kit来做的，用的序列完全匹配的一对引物，突变位点在引物的中间。本
来用的是Phusion，后来换成Pfu，结果一样。
不知道有没有这方面的高手，可以分享一下经验。
谢谢！ |
H*******i
发帖数: 196 | 2 引物二聚体吧，首先看看能不能重新设计引物，减少二聚体，要不最好换策略，因为构
建library，一个个测序费时费力，要么就是pcr中那些减少二聚体的方法，不过效果不
一定好 |
e*******e
发帖数: 342 | 3 谢谢，我试了加DMSO，没有改善。不知还有没有别的方法。
【在 H*******i 的大作中提到】
: 引物二聚体吧，首先看看能不能重新设计引物，减少二聚体，要不最好换策略，因为构
: 建library，一个个测序费时费力，要么就是pcr中那些减少二聚体的方法，不过效果不
: 一定好
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H*******i
发帖数: 196 | 4 你可以把你设计的引物和周围序列发下么。
如果很难设计可以考虑用BsaI这种酶连接 |
e*******e
发帖数: 342 | 5 Forward primer: ggtgatcaacaccnnstaccacaccgaccgg
Reverse primer: ccggtcggtgtggtasnnggtgttgatcacc
(n stands for any dNTP, s stands for C or G)
周围序列：
ACCGCCCGCGAGCTGCACAAGCTGATCAAACGGGTCAGCCGCAAGCCGGTGCTGGAGGTGATCAACACCAACTACT
CGAGCACACCGACCGGGCTGGCGGTAACGCCTACTGGAAGTCCA
谢谢帮忙分析 |
p****t
发帖数: 18 | 6 可以试试减少引物的用量，另外换High GC buffer也有可能有效。 |
e*******e
发帖数: 342 | 7 谢谢，我试一下。
【在 p****t 的大作中提到】
: 可以试试减少引物的用量，另外换High GC buffer也有可能有效。
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H*******i
发帖数: 196 | 8 deltaG到不是很夸张，-10算是可以接受吧。 不过关键一点是你的序列是完全反相互补
的，其实这种设计个人觉得不好。最好是
---------------**********
****---------------
这种设计，保证两段引物和模板退火温度，还有两段引物重叠部分退火温度差不多（我
一般PCR设置退火用60-65）。
ACCGCCCGCGAGCTGCACAAGCTGATCAAACGGGTCAGCCGCAAGCCGGTGCTGGAGGTGATCAACACCAACTACT
【在 e*******e 的大作中提到】
: Forward primer: ggtgatcaacaccnnstaccacaccgaccgg
: Reverse primer: ccggtcggtgtggtasnnggtgttgatcacc
: (n stands for any dNTP, s stands for C or G)
: 周围序列：
: ACCGCCCGCGAGCTGCACAAGCTGATCAAACGGGTCAGCCGCAAGCCGGTGCTGGAGGTGATCAACACCAACTACT
: CGAGCACACCGACCGGGCTGGCGGTAACGCCTACTGGAAGTCCA
: 谢谢帮忙分析
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e*******e
发帖数: 342 | 9 非常感谢，按照你的建议，我重新设计了部分互补的引物，正在测试中，并将会告知你
结果。
ACCGCCCGCGAGCTGCACAAGCTGATCAAACGGGTCAGCCGCAAGCCGGTGCTGGAGGTGATCAACACCAACTACT
【在 H*******i 的大作中提到】
: deltaG到不是很夸张，-10算是可以接受吧。 不过关键一点是你的序列是完全反相互补
: 的，其实这种设计个人觉得不好。最好是
: ---------------**********
: ****---------------
: 这种设计，保证两段引物和模板退火温度，还有两段引物重叠部分退火温度差不多（我
: 一般PCR设置退火用60-65）。
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: ACCGCCCGCGAGCTGCACAAGCTGATCAAACGGGTCAGCCGCAAGCCGGTGCTGGAGGTGATCAACACCAACTACT
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