i*****i
发帖数: 154 | 1 如题，我指的是cluster，也就是read1/read3算一个 READs。
谢谢 |
j*p
发帖数: 411 | |
M*P
发帖数: 6456 | 3 直接所有RNA都抓出来测序是没希望的，因为表达太低了。
【在 i*****i 的大作中提到】
: 如题，我指的是cluster，也就是read1/read3算一个 READs。
: 谢谢
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i*****i
发帖数: 154 | 4 我们想做的是LncRNA的差异表达，本来打算用array来做的，比起传统的array，LncRNA
的array还是很贵的。但是我们觉得RNA-Seq能够得到更多的信息，而且作Multiplexing
的话，一个lane可以做4-6个sample。
不过刚入门，或者说还没有入门，没有经验。
我们用Core的service。
他们提供两种flow cell，一种是8个lane的Hi-Seq2000，每条lane能得到180M的reads/
Clusters。如果是pair end的话，当然还是180M的clusters，但是reads就加倍了。另
外一种是HiSeq2500，2-lane的flow cell，rapid mode，大概能出300M的reads/
clusters, PE cluster不变，reads加倍，当然价钱也比较贵，但是turnaround time很
快。
就传统的8个lane的Hi-Seq2000而言，一个sample大概能拿到40-50M的数据（cluster）
，pair end测序的话，大概80M左右（两次测序算两个reads，但是他们来源
于一个cluster）。不知道这样的深度够不够LncRNA的分析。
另外，pair end对于分析的可靠性有没有影响，因为毕竟forwad/reverse 两个reads
都是来源于一个cluster. pair end是不是可以提高检测低表达RNA的灵敏度和可靠性。
谢谢帮忙。 |
M*P
发帖数: 6456 | 5 测的再多也用处不大，除非你能用什么手段去enrich lincRNA. 因为lincRNA表达都很
低，你测的read里面大多数都是coding gene/ribosomal RNA，基本上都浪费掉了. 之
所以有人用array，就是因为这个问题。我们最近刚做过，上千个已知lincRNA里，只有
一二百个表达量超过 1 read per million.
你不如先试试 pcr，看看一些已知的lincRNA在你的 tissue里是否表达，然后跟一些已
知的house keeping mRNA比比表达量，你就知道想用RNAseq直接全把lincRNA测出来是
不可能的 。
LncRNA
Multiplexing
reads/
【在 i*****i 的大作中提到】
: 我们想做的是LncRNA的差异表达，本来打算用array来做的，比起传统的array，LncRNA
: 的array还是很贵的。但是我们觉得RNA-Seq能够得到更多的信息，而且作Multiplexing
: 的话，一个lane可以做4-6个sample。
: 不过刚入门，或者说还没有入门，没有经验。
: 我们用Core的service。
: 他们提供两种flow cell，一种是8个lane的Hi-Seq2000，每条lane能得到180M的reads/
: Clusters。如果是pair end的话，当然还是180M的clusters，但是reads就加倍了。另
: 外一种是HiSeq2500，2-lane的flow cell，rapid mode，大概能出300M的reads/
: clusters, PE cluster不变，reads加倍，当然价钱也比较贵，但是turnaround time很
: 快。
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i*****i
发帖数: 154 | 6 lncRNA的表达一般都很低，我们做qPCR，很多CT都在30左右。但是，如果信表达量这么
低的话，array是怎么检测的呢？我们平时做普通的芯片，30000多个基因，如果过滤掉
低表达基因的话，也就8000-10000个基因的表达量还可以。 如果所有的lncRNA表达量
都很低的话，是不是意味着杂交信号会非常低，可信度也低？ |
M*P
发帖数: 6456 | 7 如果是设计的好的array，那么在选probe的阶段，会选那些probe不去pick up不需要的
信号。
【在 i*****i 的大作中提到】
: lncRNA的表达一般都很低，我们做qPCR，很多CT都在30左右。但是，如果信表达量这么
: 低的话，array是怎么检测的呢？我们平时做普通的芯片，30000多个基因，如果过滤掉
: 低表达基因的话，也就8000-10000个基因的表达量还可以。 如果所有的lncRNA表达量
: 都很低的话，是不是意味着杂交信号会非常低，可信度也低？
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j*p
发帖数: 411 | 8 1. 如果只想测量已知lncRNA的表达量差异，80M 101bp 应该够了，如果是human 样品。
2. 如果想发现新的lncRNA，200M 101bp比较合适（这也得看你做的体系是否比较特别
，如果是，那应该会有novel lncRNA）。
3. biological replicates比一个样品测得深来得重要。理由(a)transcriptome
assembly已经不是什么新闻，没有novelty；(b)有replicate才有statistics，forget
about cufflinks p-value with only one replicate；(3)如果细胞是in vivo 或者从
组织来，replicates' variation 会比你想象的大。
4. 如果是用ribo 0，reads打75折。
5. 如果是做strand specific library，不要用那种号称4小时就能做完的kit，我看过
不少于5个不同实验样品，很明显可以看到90%reads在正确的strand上，10%在错误的
strand 上（很难判断是在反链上还是由于反链没有除干净）。
6. RNA的量不要太少，那些号称用50pg的样品，出来有很多是PCR replicates (用
random barcode 有助于判断是否是从一个fragment pcr 出来的).
LncRNA
Multiplexing
reads/
【在 i*****i 的大作中提到】
: 我们想做的是LncRNA的差异表达，本来打算用array来做的，比起传统的array，LncRNA
: 的array还是很贵的。但是我们觉得RNA-Seq能够得到更多的信息，而且作Multiplexing
: 的话，一个lane可以做4-6个sample。
: 不过刚入门，或者说还没有入门，没有经验。
: 我们用Core的service。
: 他们提供两种flow cell，一种是8个lane的Hi-Seq2000，每条lane能得到180M的reads/
: Clusters。如果是pair end的话，当然还是180M的clusters，但是reads就加倍了。另
: 外一种是HiSeq2500，2-lane的flow cell，rapid mode，大概能出300M的reads/
: clusters, PE cluster不变，reads加倍，当然价钱也比较贵，但是turnaround time很
: 快。
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