C*********m
发帖数: 213 | 1 请懂ITC的高手指点一下，附图这样的结果算有相互作用么？是 peptide 滴定 protein
.是不是极弱极弱的相互作用？为什么有热效应。做过本底对照，是没有任何热效应的。 | A****w
发帖数: 244 | 2 不是高手，不觉得有specifi interaction，很小的热量估计来自dilution。
到6.5 molar ratio还是有一点点热。。。
蛋白浓度是多少啊？peptide的浓度呢？
另外不知道你所谓的本底做了那些，有buffer to buffer, peptide to buffer, and
buffer to protein三组，你都比较过吗？
其他的就是你用的buffer是不是prefectly matched（同一batch buffer，蛋白透析好
。。。） | m***y
发帖数: 627 | | C*********m
发帖数: 213 | 4 CO-IP 和 in vivo cellular activity说是有相互作用的。所谓本底对照，其实是另外
一个peptide，就差一个氨基酸，用完全一样的方法做，就没有一点点热。peptide太小
，没法透析，所以用的是用蛋白透析好的buffer，把溶在水溶液里面的peptide稀释了
50倍。
【在 A****w 的大作中提到】
: 不是高手，不觉得有specifi interaction，很小的热量估计来自dilution。
: 到6.5 molar ratio还是有一点点热。。。
: 蛋白浓度是多少啊？peptide的浓度呢？
: 另外不知道你所谓的本底做了那些，有buffer to buffer, peptide to buffer, and
: buffer to protein三组，你都比较过吗？
: 其他的就是你用的buffer是不是prefectly matched（同一batch buffer，蛋白透析好
: 。。。）
| l******n
发帖数: 143 | 5 提供点俺的意见供你参考哈,希望不要介意中英文掺杂,有的东西英文描述简单些习惯些
(1)很多物理过程和化学过程都有热效应,比如说protein oligomerization including
protein aggregation.简单说,如果有检测到的热效应,不代表一定来源于你希望研究的
那个特异性反应.需要先排除其他情况才能做出推断.在ITC实验里,有的蛋白或者其他分
子很不适应被高速搅拌,所以有可能产生沉淀,这个过程混合在其他过程中,比如有热效
应的特意反应中,可能造成没有明显规律的信号.简单的方法是ITC titration后取出
cell里的溶液看有没有明显沉淀,跑个UV-Vis spec,如果明显340-320 nm的吸收值比以
前高,有可能有大分子形成.具体一些的操作,可以先把两个反应中的分子以及其混合物(
两种分子比例尽量保证反应饱和)进行简单分析,跑柱子/胶/高速分析离心;在ITC实验后
,在cell里的混合物(应该主要是两种分子的聚合物,如果确定反应达到饱和的话)取出进
行同样手段分析,跑柱子/胶/高速分析离心.SEC解析度比较低,但有大分子形成也能很快
检测出.高速分析离心在一般条件下能快速检测出聚合物(a+b=ab)的反应情况,因为聚合
物ab比a和b要大.在你的研究对象中,如果peptide比较小( < 10 kD),用光谱类方法辅助
分析比较简单,比如CD,荧光.
(2)看thermogram,背景热量比较高,有个很基本的问题需要问你,两种分子有充分进行
buffer exchange麽?用SEC column or exhaustive dialysis都可以达到好的交换效果.
做各种control实验,缓冲液滴定到在cell里的溶液里,在syringe里的溶液滴定到buffer
里,看有无同等量级的热量出现.
(3)换其他浓度配置重复实验
(4)其他实验检测出有反应的实验条件和ITC experiment一致麽?有比较多ligand to
protein的反应有热量主要来源electrostatic interaction所以对pH和盐浓度都很敏感
,对比其他实验结果的时候先要尽量在同等实验条件下比较
俺的两分银子
protein
的。
【在 C*********m 的大作中提到】
: 请懂ITC的高手指点一下，附图这样的结果算有相互作用么？是 peptide 滴定 protein
: .是不是极弱极弱的相互作用？为什么有热效应。做过本底对照，是没有任何热效应的。
| l******n
发帖数: 143 | 6 晕,俺太土了才看到你这个回帖.CO-IP有可能有artifact,in vivo其他分子有可能有辅
助效果.如果条件允许,最好做其他在溶液中的反应测试进行比较.
peptide如果是lyophylized powder有可能有其他分子进行干扰.有很低MWCO的dialysis
membrane,你可以尝试.ITC对buffer exchange要求高.
【在 C*********m 的大作中提到】
: CO-IP 和 in vivo cellular activity说是有相互作用的。所谓本底对照，其实是另外
: 一个peptide，就差一个氨基酸，用完全一样的方法做，就没有一点点热。peptide太小
: ，没法透析，所以用的是用蛋白透析好的buffer，把溶在水溶液里面的peptide稀释了
: 50倍。
| C*********m
发帖数: 213 | 7 嗯，市面上能找到最小mwco的透析袋好像是1kDa, 估计我的peptide透析要损失60%以上
。这两个peptide表现不同可能是合成过程中的盐之类造成的。多谢。
dialysis
【在 l******n 的大作中提到】
: 晕,俺太土了才看到你这个回帖.CO-IP有可能有artifact,in vivo其他分子有可能有辅
: 助效果.如果条件允许,最好做其他在溶液中的反应测试进行比较.
: peptide如果是lyophylized powder有可能有其他分子进行干扰.有很低MWCO的dialysis
: membrane,你可以尝试.ITC对buffer exchange要求高.
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