f*******d
发帖数: 92 | 1 我刚开始做蛋白质方面的东西，是小白，希望大家赐教！我有一个蛋白A，在C
terminal加了Myc tag 和his tag, 然后在hepG2里面超表达。我想用mass spec看在A蛋
白的interacting proteins, 这种情况是用Myc tag来做IP 好呢，还是直接把lysate上
Ni TNA 的柱子呢？ |
b******y
发帖数: 627 | 2 Ni TNA 的柱子 is too nonspecific. But you can do Ni TNA 的柱子 and then Myc
tag来做IP. |
e****s
发帖数: 1125 | 3 单纯的蛋白蛋白interaction,我个人喜欢pulldown，因为下步Western不存在IGG干扰的
问题。不过Mass Spec就不知道了。建议是Imidazole特异洗脱，别用SDS buffer直接洗。
Myc做Co-IP还是不错的Tag，而且看见过几篇mass spec based proteomics用Myc.
【在 f*******d 的大作中提到】
: 我刚开始做蛋白质方面的东西，是小白，希望大家赐教！我有一个蛋白A，在C
: terminal加了Myc tag 和his tag, 然后在hepG2里面超表达。我想用mass spec看在A蛋
: 白的interacting proteins, 这种情况是用Myc tag来做IP 好呢，还是直接把lysate上
: Ni TNA 的柱子呢？
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f*******d
发帖数: 92 | 4 那用Imidazole洗脱之后，蛋白之间的interaction会被打断吗？洗脱之后还要exchange
buffer吗？还是直接可以加Myc Ab呢？
Myc
【在 b******y 的大作中提到】
: Ni TNA 的柱子 is too nonspecific. But you can do Ni TNA 的柱子 and then Myc
: tag来做IP.
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f*******d
发帖数: 92 | 5 能不能给我一篇文章的link阿？我想看看方法和他们用哪家的antibody。谢啦～
洗。
【在 e****s 的大作中提到】
: 单纯的蛋白蛋白interaction,我个人喜欢pulldown，因为下步Western不存在IGG干扰的
: 问题。不过Mass Spec就不知道了。建议是Imidazole特异洗脱，别用SDS buffer直接洗。
: Myc做Co-IP还是不错的Tag，而且看见过几篇mass spec based proteomics用Myc.
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e****s
发帖数: 1125 | 6 我懒啊。
自己搜吧，遍地都是。
【在 f*******d 的大作中提到】
: 能不能给我一篇文章的link阿？我想看看方法和他们用哪家的antibody。谢啦～
:
: 洗。
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c********b
发帖数: 363 | 7 应该不会，immidazole是histidine的mimic而已，而不是象高盐高detergent那样。
exchange
【在 f*******d 的大作中提到】
: 那用Imidazole洗脱之后，蛋白之间的interaction会被打断吗？洗脱之后还要exchange
: buffer吗？还是直接可以加Myc Ab呢？
:
: Myc
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b******y
发帖数: 627 | 8 Echo what centuribob said. |
S*********s
发帖数: 304 | 9 // non-denature Tandem purification
3XFLAG + HA
or
ProteinA beads(IgG domain)+HA/FLAG
His or myc affinity and specific 不够~
//denature purification
His and biotag 会比较好~
【在 f*******d 的大作中提到】
: 我刚开始做蛋白质方面的东西，是小白，希望大家赐教！我有一个蛋白A，在C
: terminal加了Myc tag 和his tag, 然后在hepG2里面超表达。我想用mass spec看在A蛋
: 白的interacting proteins, 这种情况是用Myc tag来做IP 好呢，还是直接把lysate上
: Ni TNA 的柱子呢？
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f*******d
发帖数: 92 | 10 多谢！ proteinA beads (IgG domain) 这个是啥意思？你说的连个都是tandem 的吗？
【在 S*********s 的大作中提到】
: // non-denature Tandem purification
: 3XFLAG + HA
: or
: ProteinA beads(IgG domain)+HA/FLAG
: His or myc affinity and specific 不够~
: //denature purification
: His and biotag 会比较好~
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U******m
发帖数: 2349 | 11 哈哈哈
【在 e****s 的大作中提到】
: 我懒啊。
: 自己搜吧，遍地都是。
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f*******d
发帖数: 92 | 12 又有一个问题，还是贴在这里把，要做IP看interacting protein, lysate是不是一定
不能用sonication, 只能用detergent来lyse cell? |
