r****o
发帖数: 105 | 1 你给的信息不够，至少得说说这两个蛋白的标签是什么吧，比如
Flag, HA, 或者myc什么的。既然你用proteinA/G，你应该还加了一种
抗体可以把两个蛋白中的一个拽下来吧？
背景高倒是很常见，因为非特异性的结合会比较严重。要做得好，
被首先拽下来的蛋白的tag要比较好才行，而且如果用多次串联的TAG
会比较好，比如6XFLAG。也有人用两种不同的TAG串联在一起，通过
两步纯化来增强特异性。另外就是最好直接用抗体共价耦联的琼脂凝胶(
比较贵，1ML可能要五百多刀)。
还有就是，一般的做法是直接把洗过的beads 直接用sample buffer
煮。这样的样品非特异性的成分会不少，但如果用TAG peptide的溶液
冲洗蛋白(比如anti-flag matrix 用flag peptide 来冲洗)，效果会好很多。
没信号也许是因为缓冲液太强，或者是因为两个蛋白结合太弱，
冲洗过程中脱落了。用crosslinker可能会有所帮助。 |
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